原创： niwanmao 流式中文网 昨天
线粒体是细胞代谢的重要介质，是活性氧（ROS）的产生者和靶点，是ATP水平和钙稳态的调节剂，也是参与氨基酸、脂质和核苷酸合成的生物合成途径的枢纽。
线粒体存在于所有细胞中，它们的大小、形状和数量不同，这取决于细胞、基础组织和其他一些因素的代谢需求。考虑到它们在细胞和机体功能中的关键作用，在许多遗传和非遗传疾病以及癌症和衰老中观察到线粒体（mt）功能障碍并不奇怪。在绝大多数情况下，mt功能障碍的显著特征包括mt膜电位（mtmP）、mt质量和氧化还原电位的变化。
流式细胞仪可以快速监测完整细胞中的所有这些参数，避免mt分离和/或破膜造成的假象。现在已经有许多mt特异性荧光探针，可用于测量mtmP、mt质量和mt内ROS，见下表：
线粒体膜电位检测原理和要点
mtmP是质子运动动力的主要组成部分，它是由mt基质泵到膜间空间的质子形成的。这种电位根据线粒体的状态而变化，与它们合成ATP的能力有关，是细胞健康的常见指标。mt基质是负电位的，因此用于测量mtmP的染料通常是亲脂性阳离子化合物，即带正电荷的分子，它们可以跨膜而不会与膜结合，并与mtmP成正比地积聚在mt基质中。超极化线粒体能积聚更多的染料，而去极化线粒体积聚的染料较少。
通过流式细胞术评估mtmP时，必须考虑两个要点：
首先，应仔细滴定染料浓度。高染料浓度会导致荧光猝灭，从而产生结果异常。虽然淬灭阈值因染料而异，但一般1–30 nM的浓度算足够低，大多能避免不必要的淬灭现象。
其次，必须使用功能性对照来确保染料信号的变化能得到正确解读，避免非特异性改变。合适的对照包括：
1.作为解偶联剂的FCCP、CCCP和valinomycin，诱导去极化。2.oligomycin，一种ATP合成酶抑制剂，诱导去极化。3.nigericin，K＋/H＋离子载体，诱导超极化。
不同线粒体膜电位染料优缺点
DiOC6已广泛用于流式细胞术研究中，但是，DiOC6作为NADH抑制剂的活性，以及对mt的毒性，强烈限制了该探针的使用。
与DiOC6相似，罗丹明123（Rh123）初用于不少研究，不过Rh123虽然容易进入细胞并迅速达到平衡，但不能很好地保留在里面。此外，在某些情况下，Rh123与线粒体的结合可能与线粒体能量状态无关，这进一步限制了其使用。
四甲基若丹明乙酯（TMRE）和四甲基若丹明甲酯（TMRM）也被广泛用于流式细胞术检测mtmP，这些染料无毒，染色后不易淬灭，但应以相对较低的浓度使用，可以在染色后立即进行分析，无需洗涤。这两种染料激发光均为488nm，发射波长574nm发射。通常，应准备未染色的样品（也称为“空白样品”），以设置背景荧光的水平。因此，通过TMRE或TMRM分析mtmP的变化时，就被定义为给定样品的MdFI的变化。
碳花青染料，尤其是JC-1被认为是检测mtmP的可靠探针。JC-1具有多色荧光发射光谱，并允许对mt去极化进行比例式半定量评估。在单体状态下，它发出绿色荧光（529 nm），而在高度依赖于mtmP的聚集状态下，它发出橙红色荧光（> 590 nm），在化合物诱导mtmP崩溃时，JC-1也会成为单体。这意味着，在健康细胞中，可以出现少量绿色，大多数为橙红色荧光，线粒体去极化的细胞大多仅显示绿色荧光。考虑到由于mtmP变化引起的荧光变化，显示结果的j方法是指示mtmP高或低的细胞百分比，而不是绿色和橙红色荧光之间的比率。
自1993年以来，据报道，JC-1是几种细胞类型和测定条件的可靠膜电位指示剂，并且其与其他荧光探针的兼容性也已在多色方案中得到了证明。但是，JC-1对过氧化氢敏感、光敏感以及单体与聚集体形式之间的平衡速度较慢，可能会在一定程度上限制其使用。其它类似于JC-1的还有JC-9和JC-10，JC-9的单体或聚集体形式在522 nm激发，分别以535或635 nm发射。JC-10在490 nm激发，并在520 nm（单体形式）或590 nm（聚集形式）发射。
线粒体质量检测染料
线粒体质量可通过使用能够结合特定mt成分的染料进行监测，而与mt极化状态无关。因此，荧光量与mt含量成正比。Mito ID和nonyl acridine orange（NAO）这两种染料能与mt内膜的cardiolipin结合，而MitoTracker染料与mt蛋白中存在的半胱氨酸残基的巯基反应。其中一些染料，包括MitoTracker deep red 633，也与mt蛋白形成共价键，因此在细胞染色后可以固定。与TMRE和TMRM类似的是，对于MitoTracker染料，应测量MdFI的变化。
线粒体ROS检测染料
关于mt ROS，近开发了两种荧光探针，分别是MitoSOX和mi，以分别标记线粒体中的阴离子超氧化物和过氧化氢。
MitoSOX是氢乙啶化合物，可靶向定位到线粒体，依赖mtmP积累到线粒体中，氧化后与线粒体DNA结合后发出荧光。与其他探针类似，当使用MitoSOX和mi时，必须准备足够的阳性和阴性对照全面验证生物系统中mt H2O2的存在。Antimycin A或阿霉素是MitoSOX染色的j阳性对照，而外源H2O2则是mi的正确阳性对照。MitoSOX染色的阴性对照是细胞可渗透的超氧化物歧化酶模拟物或mt解偶联剂，具体取决于细胞类型。对照的其它制备形式也可以用抗氧化剂来处理，例如N-乙酰半胱氨酸或其他能大大减少自由基产生的特异性清除剂。
目前已有不少文献通过流式细胞术对MitoSOX和mi进行了测试，能选择性定量角质形成细胞、内皮细胞、成纤维细胞和几种癌细胞系中的mt阴离子超氧化物和mt过氧化氢，也有报道可能在同一细胞中同时使用MitoSOX和mi来分析活细胞中的mt ROS。
