BIA Separations！让病毒纯化更高效---基因治疗-化工仪器网-手机版

基因治疗是目前生物医药领域热门的话题之一，生物医药行业对基因治疗持续高涨的热情，令该领域许多公司开始将一次治愈性基因疗法，作为其开发的战略核心。
有行业报告显示，未来预计 6 年内，将有多达 60 种基因疗法获得批准，这些基因疗法在 2024 年的销售额将达到 146 亿美元。
基因治疗的核心是基因载体，病毒载体占据着主导地位。目前腺相关病毒（AAV）和慢病毒（LV）是临床上广泛使用的病毒载体。

从 2012 年荷兰 UniQure 公司的，世界上 AAV 基因治疗药物 Glybera 在欧盟获上市，到 2016 年 GSK 与意大利 San Raffaele 合作开发的 LV 基因治疗药物 Strimvelis 再次在欧盟获批，再到 2017 年诺华获得 FDA 肿瘤药物咨询委员会以 10:0 的投票结果，一致批准的自体回输 CAR-T 细胞疗，及同年 Spark Therapeutics 公司获 FDA 批准的一个传疾病的基因治疗药物 Luxturna，AAV 和 LV 越来越成为基因治疗的主角。AAV 和 LV 大都采用质粒瞬时转染方法生产，从而高质量、高纯度的质粒是制 AAV、LV 等病毒载体的前提条件。

质粒是常见的分子生物学工具，是一段 DNA 双螺旋结构。而抽提质粒几乎是分子生物学基础实验之一。

科研水平的实验，通常的质粒抽提试剂盒就足以满足微克至数毫克级的需求，但是如果需要大规模制备病毒载体，试剂盒的质粒产量就非常的力不从心了。
此外，包装病毒通常需要三个质粒或四个质粒，每个质粒大小、序列都不一样，上游表达量也有区别，甚至稳定性都有差异。

面对如此众多品种的质粒，有没有一种质粒 DNA 纯化平台，能够适用多种质粒的、可放大的，满足基因治疗、细胞治疗和疫苗的高纯度和同质性的标准要求，并且还需要有效，稳健和可扩展的下游过程呢?

接下来为大家隆重介绍 BIA Separations 提供的，基于对流相互作用介质（CIM）层析整体柱的两步质粒 DNA（pDNA）纯化平台！
该方法除了具有以上全部优点，并且可以明显降低纯化时间，提高生产效率，使其成为 GMP 环境下的大规模 pDNA 纯化的选择。
该方法专为纯化大分子和纳米颗粒的整体柱而设计，可实现快速操作，高流量，同时提供动态结合能力和分辨率。

首先要为整个过程中的核心——两步层析步骤，准备细菌培养液

1. 大肠杆菌收获、裂解－碱裂解：

这是快速高效纯化质粒 DNA 亚型的基础。

操作建议：

先收集菌体；
然后采用碱性裂解法制备原料；

再将细菌细胞（通常是细胞生物质或细胞沉淀）悬浮在 50 mMTris-HCl，10 mM EDTA，pH8.0 中；

通过加入等体积的 0.1-0.4M NaOH，1%SDS 进行裂解。

2. 裂解液浓缩：

氯化钙沉淀后澄清，除去了大量的主要样品杂质

裂解后，悬浮液变粘稠，通过加入与悬浮缓冲液等体积的，4-8℃ 冷却的 3M CH 3 COOK（pH 5.5）沉淀细胞碎片和 SDS 复合物。

在温和混合下，缓慢加入 CaCl2 并孵育 15 分钟。

TIPS:

1. 氯化钙用作沉淀剂，以去除 RNA、基因组 DNA 和其他杂质;

2. 较高浓度的杂质需要 CaCl2 浓度高达 1M;

3. 考虑测试多种浓度并评估产品中杂质的有效去除和未受影响的 pDNA 产量;

4. 加入速度应该很慢，以防止局部温度上升;

5. 孵育后，进行一系列澄清步骤，从离心或粗过滤开始，例如 80μm 深度过滤，并以 1-5μm 过滤结束。

（低温有利于沉淀，混合过程应该温和操作，以防止 DNA 降解。）

前面 blabla 说了那么多，然而纯化才是本工艺的精华所在。

BIA Separations 的二步纯化工艺的稳健性、连贯性、时效性，均堪称教科书式的经典。

首先纯化的柱子，通过弱阴离子交换，浓缩 pDNA 并去除大部分 HCP、mRNA 和基因组 DNA；

第二步利用疏水相互作用色谱（HIC）的抛光步骤，进一步从超螺旋（SC）治疗级 pDNA 中除去开环（OC）和线性 pDNA 亚型。

两步纯化的作用功能明确、互相合作，大大节省操作步骤和时间。

AEX 色谱柱（CIMmultus™DEAE）浓缩 pDNA，并去除大部分 HCP、mRNA 和基因组 DNA。

在弱阴离子交换柱上捕获质粒 DNA，其中除去剩余的 RNA 和蛋白质，样品结合需要低电导率，通过稀释实现。

随着增加 NaCl 的梯度洗脱，首先洗脱 RNA，然后洗脱质粒 DNA。

层析条件

Monolithic column:	CIMmultus™ DEAE(2 µm)*1
phase:	Equilibration buffer A1: 50 mM Tris, 10 mM EDTA, pH 7.2
	Washing buffer A2: 50 mM Tris, 10 mM EDTA, 0.6 M NaCl, pH 7.2
	Elution buffer A3: 50 mM Tris, 10 mM EDTA, 1 M NaCl, pH 7.2
Working flow rates:	0.5 – 5 column volume (CV) /min (具体取决于样品特性，使用的层析设备和色谱柱尺寸)

*1 选择色谱柱体积，取决于需要处理的样品量。

层析方法

1. 用去离子水稀释细菌裂解物至电导率为 35-40mS / cm。稀释取决于样品制备过程中添加的 CaCl2 浓度。

2. 将稀释的样品用 0.45μm 过滤器进行过滤。

3. 将 20CV 的缓冲液 A1 平衡 DEAE 柱。

4. 将澄清的稀释细菌裂解液进行上样。

5. 用 20 CV 的缓冲液 A1 对色谱柱进行流洗。

6. 用 20 CV 的缓冲液 A2 对色谱柱进行流洗。

7. 用 20 CV 的缓冲液 A3（以半工作流速）洗脱并收集 pDNA。

图 1：AEX CIMmultus™DEAE（2μm）柱上的质粒 DNA 洗脱曲线

在高配体密度丁基修饰的（CIMmultus TM C4 HLD）整体柱上，利用疏水相互作用色谱柱（HIC）的抛光步骤，进一步从超螺旋（SC）治疗级 pDNA 中除去开环（OC）和线性 pDNA 亚型。

为了富集质粒 DNA 的超螺旋亚型，将 DEAE 洗脱液上样到高配体密度丁基柱（C4 HLD）上。

该步骤进一步去除了杂质。

层析条件

phase:	Equilibration buffer B0: 50 mM Tris, 10 mM EDTA, 3 M (NH4)2SO4, pH 7.2
	Washing buffer B1: 50 mM Tris, 10 mM EDTA, 1.7 M (NH4)2SO4, pH 7.2
	Adjustment buffer: 4 M (NH4)2SO4
	Elution buffer B2: 50 mM Tris, 10 mM EDTA, 0.4 M (NH4)2SO4 , pH 7.2
	Regeneration buffer A1: 50 mM Tris, 10 mM EDTA, pH 7.2
Working flow rates:	0.5 – 5 CV/min (具体取决于样品特性、使用的层析设备和色谱柱尺寸)