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BIA Separations!让病毒纯化更高效---基因治疗

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2020/4/28 15:28:30

基因治疗是目前生物医药领域热门的话题之一,生物医药行业对基因治疗持续高涨的热情,令该领域许多公司开始将一次治愈性基因疗法,作为其开发的战略核心。
   有行业报告显示,未来预计 6 年内,将有多达 60 种基因疗法获得批准,这些基因疗法在 2024 年的销售额将达到 146 亿美元。
   
基因治疗的核心是基因载体,病毒载体占据着主导地位。目前腺相关病毒(AAV)和慢病毒(LV)是临床上广泛使用的病毒载体。

   从 2012 年荷兰 UniQure 公司的,世界上 AAV 基因治疗药物 Glybera 在欧盟获上市,到 2016 年 GSK 与意大利 San Raffaele  合作开发的 LV 基因治疗药物 Strimvelis 再次在欧盟获批,再到 2017 年诺华获得 FDA 肿瘤药物咨询委员会以 10:0 的投票结果,一致批准的自体回输 CAR-T 细胞疗,及同年 Spark Therapeutics 公司获 FDA 批准的一个传疾病的基因治疗药物 Luxturna,AAV 和 LV 越来越成为基因治疗的主角。AAV 和 LV 大都采用质粒瞬时转染方法生产,从而高质量、高纯度的质粒是制 AAV、LV 等病毒载体的前提条件

  质粒是常见的分子生物学工具,是一段 DNA 双螺旋结构。而抽提质粒几乎是分子生物学基础实验之一。

  科研水平的实验,通常的质粒抽提试剂盒就足以满足微克至数毫克级的需求,但是如果需要大规模制备病毒载体,试剂盒的质粒产量就非常的力不从心了。
  此外,包装病毒通常需要三个质粒或四个质粒,每个质粒大小、序列都不一样,上游表达量也有区别,甚至稳定性都有差异。

   面对如此众多品种的质粒,有没有一种质粒 DNA 纯化平台,能够适用多种质粒的、可放大的,满足基因治疗、细胞治疗和疫苗的高纯度和同质性的标准要求,并且还需要有效,稳健和可扩展的下游过程呢?



 

   接下来为大家隆重介绍 BIA Separations 提供的,基于对流相互作用介质(CIM)层析整体柱的两步质粒 DNA(pDNA)纯化平台!
   该方法除了具有以上全部优点,并且可以明显降低纯化时间,提高生产效率,使其成为 GMP 环境下的大规模 pDNA 纯化的选择。
   该方法专为纯化大分子和纳米颗粒的整体柱而设计,可实现快速操作,高流量,同时提供动态结合能力和分辨率。



 

首先要为整个过程中的核心——两步层析步骤,准备细菌培养液
 

1. 大肠杆菌收获、裂解-碱裂解:
 

这是快速高效纯化质粒 DNA 亚型的基础。
 

操作建议:
 

  先收集菌体;
  然后采用碱性裂解法制备原料;

  再将细菌细胞(通常是细胞生物质或细胞沉淀)悬浮在 50 mMTris-HCl,10 mM EDTA,pH8.0 中;

  通过加入等体积的 0.1-0.4M NaOH,1%SDS 进行裂解。

2. 裂解液浓缩:
 

氯化钙沉淀后澄清,除去了大量的主要样品杂质

​​​​​​​   裂解后,悬浮液变粘稠,通过加入与悬浮缓冲液等体积的,4-8℃ 冷却的 3M CH 3 COOK(pH 5.5)沉淀细胞碎片和 SDS 复合物。

​​​​​​​   在温和混合下,缓慢加入 CaCl2 并孵育 15 分钟。

TIPS:
 

1. 氯化钙用作沉淀剂,以去除 RNA、基因组 DNA 和其他杂质;

2. 较高浓度的杂质需要 CaCl2 浓度高达 1M;

3. 考虑测试多种浓度并评估产品中杂质的有效去除和未受影响的 pDNA 产量;

4. 加入速度应该很慢,以防止局部温度上升;

5. 孵育后,进行一系列澄清步骤,从离心或粗过滤开始,例如 80μm 深度过滤,并以 1-5μm 过滤结束。

(低温有利于沉淀,混合过程应该温和操作,以防止 DNA 降解。)

 


 

前面 blabla 说了那么多,然而纯化才是本工艺的精华所在。
 

BIA Separations 的二步纯化工艺的稳健性、连贯性、时效性,均堪称教科书式的经典。
 

首先纯化的柱子,通过弱阴离子交换,浓缩 pDNA 并去除大部分 HCP、mRNA 和基因组 DNA;
 

第二步利用疏水相互作用色谱(HIC)的抛光步骤,进一步从超螺旋(SC)治疗级 pDNA 中除去开环(OC)和线性 pDNA 亚型。
 

两步纯化的作用功能明确、互相合作,大大节省操作步骤和时间。



 

​​​​​​​   AEX 色谱柱(CIMmultus™DEAE)浓缩 pDNA,并去除大部分 HCP、mRNA 和基因组 DNA。

​​​​​​​   在弱阴离子交换柱上捕获质粒 DNA,其中除去剩余的 RNA 和蛋白质,样品结合需要低电导率,通过稀释实现。 

​​​​​​​   随着增加 NaCl 的梯度洗脱,首先洗脱 RNA,然后洗脱质粒 DNA。

 

层析条件
 

Monolithic column:

CIMmultus™  DEAE(2 µm)*1

phase:

Equilibration  buffer A1: 50 mM Tris, 10 mM EDTA,   pH 7.2

 

Washing buffer  A2: 50 mM Tris, 10 mM EDTA, 0.6 M   NaCl, pH 7.2

 

Elution buffer  A3: 50 mM Tris, 10 mM EDTA, 1 M   NaCl, pH 7.2

Working flow rates:

0.5 – 5 column volume (CV) /min (具体取决于样品特性,使用的层析设备和色谱柱尺寸)

*1 选择色谱柱体积,取决于需要处理的样品量。
 

层析方法
 

1.  用去离子水稀释细菌裂解物至电导率为 35-40mS / cm。稀释取决于样品制备过程中添加的 CaCl2 浓度。

2.  将稀释的样品用 0.45μm 过滤器进行过滤。

3.  将 20CV 的缓冲液 A1 平衡 DEAE 柱。

4.  将澄清的稀释细菌裂解液进行上样。

5.  用 20 CV 的缓冲液 A1 对色谱柱进行流洗。

6.  用 20 CV 的缓冲液 A2 对色谱柱进行流洗。

7.  用 20 CV 的缓冲液 A3(以半工作流速)洗脱并收集 pDNA。


图 1:AEX CIMmultus™DEAE(2μm)柱上的质粒 DNA 洗脱曲线



 

​​​​​​​    在高配体密度丁基修饰的(CIMmultus TM C4 HLD)整体柱上,利用疏水相互作用色谱柱(HIC)的抛光步骤,进一步从        超螺旋(SC)治疗级 pDNA 中除去开环(OC)和线性 pDNA 亚型。

​​​​​​​ ​​​​​​​   为了富集质粒 DNA 的超螺旋亚型,将 DEAE 洗脱液上样到高配体密度丁基柱(C4 HLD)上。 

​​​​​​​ ​​​​​​​   该步骤进一步去除了杂质。

 

层析条件

 

phase:

Equilibration  buffer B0:   50 mM Tris, 10 mM EDTA, 3 M   (NH4)2SO4, pH 7.2

 

Washing  buffer  B1: 50 mM Tris, 10 mM EDTA, 1.7  M (NH4)2SO4, pH 7.2

 

Adjustment  buffer: 4 M (NH4)2SO4

 

Elution  buffer  B2: 50 mM Tris, 10 mM EDTA, 0.4  M (NH4)2SO4 , pH 7.2

 

Regeneration  buffer A1: 50 mM Tris, 10 mM EDTA, pH 7.2

Working flow  rates:

0.5 – 5 CV/min (具体取决于样品特性、使用的层析设备和色谱柱尺寸)

*2 选择色谱柱体积,取决于需要处理的样品量。
 

层析方法

 

1.  调节来自 DEAE 柱的含 pDNA 洗脱液,每 1 体积(V)洗脱液加入 3 体积(V)的 4M(NH4)2SO4。

2.  用 20CV 的缓冲液 B0 来平衡 C4 HLD 柱。

3.  将 DEAE 柱洗脱的 pDNA 组份上样。

4.  用 20 CV 的缓冲液 B1 流洗色谱柱。

5.  用缓冲液 B2(以半工作流速)洗脱并收集 pDNA。

6.  用 30 CV 的缓冲液 A1 再生色谱柱。

7.  加样 3 次后,对柱子进行清洗。


图 2:在 HIC CIMmultus TM C4 HLD(2μm)柱上分离超螺旋质粒 DNA



 

·  从 C4 HLD 柱洗脱的超螺旋 pDNA 组份含有硫酸铵,必须在生物应用质粒之前将其除去。

·  缓冲液交换可通过透析滤过或体积排除色谱等方法进行。

·  配置和填充可能需要额外的处理。
 

二步法层析过程分析:

 

​​​​​​​    质粒 DNA 制造成功的关键是实时过程控制方法,确保终产品中高百分比的超螺旋 pDNA。 

​​​​​​​​​​   CIMac™pDNA 分析柱可用于监测降解产物(开环和线性 pDNA),去除杂质(RNA),并确保每个生产步骤都能产生预期的超螺旋 pDNA 量。

​​​​​​​   ​​​​​​​CIMac™pDNA 分析柱还用于超螺旋质粒 DNA 含量的质量控制。


图 3:使用 CIMac™pDNA-0.3 分析柱的质粒 DNA 亚型含量的质量控制

 

结果和结论:
 

​​​​​​​ ​​​​​  通过优化裂解、沉淀和两种色谱步骤相结合,可生产满足所有监管要求的纯 pDNA。

​​​​​​​ ​​​​​​​  可以完成去除 99% 以上的主要杂质(RNA,基因组 DNA,宿主细胞蛋白,内毒素和开环 pDNA)。

​​​​​​​ ​​​​​​​  此外,快速(大肠杆菌的 pDNA 提取和纯化可在几小时内完成),可重复的过程可降低运营成本并提高工厂生产率。 

​​​​​​​ ​​​​​​​  *的整体特性有助于该过程的直接可扩展性,涵盖从小规模实验室到大规模工业纯化 pDNA 的生产水平。

Table 1: Process results.

 

Process  yield

>  80 %

A260/280

1.92

Homogeneity  (SC pDNA)

>  97 %

HCD  – removed

>  99.5 %

HCP  - removed

>  99 %

Endotoxin

<  2 EU/mg pDNA

RNA  - removed

>  99 %

 

点评 
 

目前市面上有不少质粒纯化工艺方案,但是比较下来,BIA 二步法纯化工艺具有两大优势:
 

​​​​​​​  效率明显提高

只需两步色谱和高流速的整体柱色谱方案,减少工艺步骤(提高回收率)并加快纯化速度,从而显著提高生产率。
 

​​​​​​​   灵活放大

由于特定的整体柱设计,质粒 DNA 过程可以快速扩展到更大的单位。 

在 1 毫升色谱柱上设计的工艺可以轻松转移到试验和生产规模。

在 8L 色谱柱上单次运行可以产生 48 g 药物级 scDNA。
 

Table 2: Scale up options.

 

Column size

pDNA  purified per cycle

1  mL

6  mg

8  mL

48  mg

80  mL

480  mg

800  ml

4.8  g

8000  mL

48  g

 

十多年来,BIA Separations 一直是高效率质粒纯化的好选择。它不仅提供整体柱和平台模板,还提供定制的纯化服务,以*您的质粒 DNA 纯化需求

159 0176 2218(VX同号)

 


 

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