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凋亡检测常见问题

上海炎彬化工科技有限公司

2017/3/30 11:57:36

实验过程中Annexin V染不上色或阳性率偏低。

l         确定实验中的诱导剂是否能产生凋亡。可通过设定确切凋亡诱导效果的阳性药物对照来排除这一情况。

l         贴壁细胞消化不当。Annexin V 跟PS 的结合需要Ca2+离子,结合液中含有Ca2+,EDTA 的消化会影响染色,建议使用无EDTA 的胰酶,或者消化后用PBS洗涤干净。

l         细胞离心用冷PBS 洗涤后,应尽量吸干残余液体,残余过多的PBS 中含有磷酸根,会形成磷酸钙沉淀,影响Annexin V的染色。

l         Annexin V结合液瓶盖要盖紧密封,长时间暴露于空气后,空气中的CO2 进入后形成CaCO3 会产生沉淀,从而减少游离的Ca2+,导致实验的结果不佳。

l         污染其他的缓冲液。如吸取PBS后不更换Tip 头会导致游离的Ca2+的减少,从而导致实验的结果不佳。

l         阳性细胞的丢失。如果是贴壁细胞,药物诱导后漂浮的细胞要收集起来合并检测,这部分细胞往往是凋亡阳性的细胞,丢弃会造成阳性结果偏低。

 

实验过程中阳性率偏高。

l         细胞本身活力太差。实验中发现未经诱导凋亡的对照细胞经染色后AnnexinV+/PI+双阳性的细胞比例过高,造成这种结果的原因可能是细胞本身活力太差。建议用台盼蓝染色计算细胞的活力,台盼蓝拒染的细胞应大于95%。若活力偏低低,建议重新复苏细胞,通常刚复苏的细胞至少要传代3 次以后才能进行实验。

l         细胞操作不当。贴壁细胞消化过程中反复剧烈吹打导致细胞膜破坏,使得假阳性偏高。

l         凋亡诱导时间过长。一般情况下诱导几个小时就可以出现早期凋亡,因此通常不需要处理大于48 小时以上,诱导时间过长会使营养物质耗尽,导致细胞状态差,假阳性结果偏高。

 

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