碱性成纤维细胞生长因子抗体的研究

碱性成纤维细胞生长因子，bFGF）是一种重要的多肽生长因子，也是FGF家族中原型成员之一。从1974年Gospodarowicz等［1］从牛脑中分离出FGF以来，近二十多年研究表明，bFGF在促进血管生成［2］、创伤愈合［3］、骨骼修复［4］、神经营养与修复［5］、眼晶体再生［6］以及胚胎的发育与分化［7］方面均显示出生物学活性。近年研究发现bFGF在恶性肿瘤组织中有强烈表达，并与肿瘤病理分级、分期呈正相关，同时血清中bFGF水平亦明显增高，这提示bFGF表达增强与肿瘤恶性程度增高、侵袭力增强有密切关系，可作为恶性肿瘤的早期诊断与预后指标［8］。因此，制备bFGF抗体对建立免疫学技术定量分析，研究阻断bFGF在体外、体内的促细胞增殖作用，抑制肿瘤血管形成作用及阻止肿瘤恶性转化与发展都有十分重要的意义。本文就近年来在bFGF抗体的制备、鉴定及应用等方面的研究进展作一综述。（basic fibroblast growth factor

　　一、bFGF抗体的制备［9，10，19］

　　应用免疫学技术和细胞融合技术，人们已成功制备出鼠源和兔源的bFGF抗体。

　　（一）bFGF单克隆抗体的制备　常用抗原为牛bFGF或人bFGF。根据融合细胞的不同，bFGF单克隆抗体的制备方法可分为两种：

　　1.脾细胞融合制备bFGF单克隆抗体　将1 mg牛bFGF抗原溶于5 mL生理盐水中，与等体积的弗氏*佐剂双推法混匀，经腹部皮下多点注射免疫雌性BALB/C小鼠（体重18～20 g），抗原用量每只8μg/0.3 mL。2周后用等量抗原与不*佐剂混匀后同上述方法免疫。再过1周后连续每周用bFGF加强免疫1次（每只10μg/0.1mL），共3次。zui后一次免疫3　d后，取免疫小鼠脾细胞与SP2/0细胞按1∶1.8在0.7　mL 50%　PEGMW　2000中融合，分置于已加有腹腔细胞3×104～4×104/孔的96孔板HAT培养基中进行培养。3 d后换液，7 d后可见杂交瘤细胞稳定生长，14 d后开始取杂交瘤上清筛选阳性细胞株。

　　2.淋巴细胞融合制备bFGF单克隆抗体　将1 mg人bFGF抗原溶于5 mL生理盐水中，取0.5 mL与等体积的弗氏*佐剂超声乳化，自足垫部注射4～6周雌性BALB／C小鼠，双足垫免疫至足部肿胀为宜。2周后用等量抗原与不*佐剂混匀后同上述方法免疫。1周后连续每周用bFGF加强免疫1次（淋巴结直接注射），共3次。zui后一次免疫3 d后，取免疫小鼠淋巴细胞与SP2/0细胞按1∶2～4在1 mL 50% PEG-4000中融合，分置于已加有腹腔细胞3×104～4×104/孔的96孔板HAT培养基中进行培养。1周后半量换液。换液3～4 d后可见杂交瘤细胞稳定生长，1周后开始取杂交瘤上清筛选阳性细胞株。

　　（二）bFGF抗血清的制备

　　1.鼠抗血清的制备　同（一）中的1.或2.法免疫小鼠，将免疫好的小鼠眼眶放血收集抗血清。

　　2.兔抗血清的制备　将弗氏*佐剂与bFGF抗原混合制成乳状液体免疫家兔，共8次，当效价达到1∶2000时，颈动脉放血收集抗血清。

　　二、bFGF单克隆抗体的筛选与鉴定［9,10］

　　（一）bFGF单克隆抗体的筛选与克隆化　杂交瘤细胞在HAT培养液中生长形成克隆后，其中仅少数是分泌bFGF单克隆抗体的细胞，而且多数培养孔中有多个克隆生长，分泌的抗体也可能不同。因此，必须进行筛选和克隆化。

　　1.bFGF单克隆抗体的筛选　要求所测抗体的方法高度灵敏、快速、特异，且便于大量检测。常用的方法有间接ELISA法、间接血凝试验、放射免疫测定、免疫酶斑点实验等。

　　（1）反向间接血凝试验　向各孔加入25μL生理盐水，用稀释棒蘸取各待测上清依次转动稀释。同时，用小鼠抗bFGF抗体作为阳性对照，HAT*培养液为阴性对照；再向各孔加入25μL 0.5%的兔抗小鼠IgG、IgM致敏SRBC，在微型震荡器上震1　min，37℃3　h后观察结果。

　　（2）间接ELISA检测bFGF抗体　以0.01 mol/L pH 9.6碳酸盐缓冲液包被bFGF抗原，每孔100 ng/μL，其余按常规方法进行。1∶200 PBS-T稀释鼠抗bFGF为阳性对照，未被免疫的正常小鼠血清作为阴性对照。OD值高于阴性3～10倍者为阳性杂交瘤。

　　2.杂交瘤细胞克隆化　为防止无关克隆的过度生长，对阳性孔需进一步克隆化。常用方法有：有限稀释法、软琼脂法、显微挑选法等。

　　（二）bFGF单克隆抗体的鉴定

　　1.效价测定　采用间接ELISA法和反向间接血凝试验。

　　2.Western blot　对纯化的牛及人bFGF抗原进行非还原性SDS-PAGE分离后，电转移至NC膜上，按Western blot试剂盒中说明书进行杂交。

　　3.斑点免疫法　将不同浓度的bFGF点于NC膜上，冷风干燥后，重复点样共20μL/点，余按Western blot方法进行封闭、漂洗、加样和显色。

　　4.中和抗体试验　将对数生长期的3T3细胞按5?000个细胞/100μL，加入96孔板中，用120　mL/L胎牛血清的DMEM培养液培养24　h。阴性对照孔加入10　ng的bFGF/孔；实验孔加入1∶102～1∶106稀释的bFGF单克隆抗体与1　mg/L的bFGF中和后的bFGF10　ng/孔；空白对照以含0.4%胎牛血清的DMEM培养液代替。连续培养36　h后，于显微镜下观察细胞数量及生长状况。

　　三、bFGF抗体的应用

　　（一）用于bFGF的定量分析　bFGF临床起效剂量甚微，在1 ng/mL下即可发挥生理作用，其作为药品的常规用量亦多在数百纳克至几十微克间，经典的蛋白质测定方法已无法检测到。冯等［11］结合常规ELISA法，用兔抗bFGF抗体作为*抗体、辣根过氧化物酶标记羊抗兔IgG作为第二抗体、2,2′-连氮-双-（3-乙基苯并噻唑啉磺酸）（2,2′-azino-di-（3-ethylbenzthi azoline sulfonate）, ABTS）为底物，自行研制、开发了一套bFGF检测试剂盒，建立了快速、准确定量分析微量bFGF的方法。此法可用于生产过程中对制品进行质量控制，对含有bFGF药物成品的质量监控以及临床上对bFGF的检测。

　　（二）用于bFGF的定位检测　Schulze Osthoff等［12］应用间接免疫过氧化物酶技术，通过亲和纯化的高度专一性抗血清检测了大量的人正常的、炎症的和肿瘤组织上的bFGF，以确定其在细胞中的分布。他们发现：在正常的胸腺、胎盘组织，特别是树突细胞中含有bFGF，在皮肤活体组织的基底细胞和腺体内皮细胞也有高水平表达，在这些部位的慢性炎症组织中相应的纤维细胞和内皮细胞也明显增生。在肿瘤组织，浸润性细胞和内皮细胞优势产生bFGF。Yamamoto等［13］用anti-bFGF抗体在鼠视网膜损伤恢复中对bFGF进行免疫组化定位，发现bFGF在氪激光致凝损伤中心增生的视网膜内皮细胞细胞核和细胞质，以及损伤周围的视网膜内皮细胞核，均有免疫活性。Reilly等［14］用体细胞融合技术产生了一个bFGF单克隆抗体DG2，作为一种功能性抗体，它在检测bFGF对细胞生长、发育、增殖等生理过程的作用具有重要意义，在bFGF免疫分析、免疫组化研究方面具有广泛的应用。

　　（三）分离纯化bFGF　Massogllia等［15］开发出了6、8、38、42等4种bFGF单克隆抗体，以识别牛bFGF的完整的或失去氨基末端的结构，bFGF单克隆抗体8、42已被用于两步ELISA以发现bFGF的完整结构。这种ELISA对38.5　fmole/well的bFGF很敏感，而且不会被牛脑中的酸性成纤维细胞生长因子（acidic fibroblast growth factor，aFGF）影响。这些bFGF单克隆抗体可被用于区别天然的和去除1～15氨基酸的bFGF，并能把bFGF和aFGF及其他的生长因子区分开。

　　（四）抑制bFGF生物活性　近年来，随着bFGF及其抗体研究的深入，发现通过抑制bFGF生物活性从而抑制某些组织病变，阻断疾病的发生发展，为一些疾病的治疗提供了新的方法。

　　1.治疗视网膜增生　视网膜增生是糖尿病患者常见并发症。Morisaki等［16］从内皮细胞和外膜细胞的相互作用以及外膜细胞的显型改变阐明了视网膜增生免疫疗法的机制。他们克隆培养了正常和患糖尿病兔视网膜内皮细胞和外膜细胞，发现在体外，来自于正常兔的外膜细胞条件培养基对患糖尿病兔内皮细胞血管生成的刺激作用大于正常的内皮细胞，而bFGF和转型生长因子β1（transforming growth factor-beta 1,TGF β1）对糖尿病患者内皮细胞血管生成的刺激也大于正常的内皮细胞。这表明，糖尿病患者内皮细胞增殖速度大于正常的内皮细胞。而来自糖尿病兔的外膜细胞条件培养基，对正常内皮细胞血管生成的刺激作用大于正常兔外膜细胞条件培养基，则说明糖尿病患者外膜细胞比正常外膜细胞分泌出更多的血管生成因子。上述结果说明，糖尿病患者视网膜增生是由于内皮细胞和外膜细胞的相互作用及糖尿病患者内皮细胞和外膜细胞的显型改变引起的。他们同时还发现来自正常和患糖尿病兔的外膜细胞条件培养基的血管生成作用、促有丝分裂作用和迁移活性均同样地被anti-bFGF抗体抑制，这为应用anti-bFGF抗体治疗糖尿病患者视网膜增生提供了有力的依据。

　　2.治疗肌内膜增生　肌内膜增生是动脉重建手术中常见并发症。Randone等［17］研究了聚四氟乙烯动脉移植后anti-bFGF多克隆抗体对平滑肌增生的抑制作用。他们发现聚四氟乙烯移植后，在结合部位和移植部位bFGF对平滑肌细胞增生起着主要作用，anti-bFGF多克隆抗体能抑制bFGF活性，可用于抑制肌内膜增生的形成。Cucina等［18］发现丝氨酸蛋白凝血酶在血管壁的愈合及肌内膜增生zui终形成中具有主要作用，它刺激平滑肌细胞释放出更多的bFGF而引起肌内膜增生，anti-bFGF抗体可抑制凝血酶促有丝分裂作用，从而阻断肌内膜增生的形成。

　　3.治疗矽肺纤维化　矽肺是矽尘作业中常见、多发的重要职业病，至今仍无有效疗法。刘凯珊等［19］根据矽肺病变规律，针对成纤维细胞是纤维化的关键和巨噬细胞能够释放bFGF而刺激成纤维细胞增生的重要环节，采用抗bFGF血清中和bFGF，减少成纤维细胞的增生，从而阻断病变的发生发展。

　　4.治疗肾癌　肾癌是一种富含血管的肿瘤，血管形成是肿瘤生长、侵袭甚至转移所必需的。bFGF作为血管形成因子不但能促进肿瘤血管形成，还具有介导肿瘤生长的作用［20］，在肾癌发生发展过程中已受到人们的重视。Mydlo等［21］研究发现肾癌组织中可提取分离出bFGF，其能够促进肾癌细胞增殖；Fujimoto等［22］报道了肾癌病人血清中bFGF含量增高，进一步表明肾癌能够合成及分泌bFGF，其水平与肿瘤病理分级、分期呈正相关。这些说明bFGF在肾癌细胞增殖和血管形成等方面起着重要作用。Emoto等［23］发现bFGF抗体能够抑制肾癌细胞生长；Reilly等［14］发现anti-bFGF抗体DG2对体外培养的幼仓鼠肾脏内皮细胞上bFGF位点具有高度亲和力，对一个血管发生的鼠肾内体模型中bFGF对血管生成的应答具有高度抑制性；Emoto等［24］也报道bFGF抗体可*抑制肾癌细胞微血管内皮细胞血管形成。这些研究成果为肾癌的治疗提供了新的思路。

　　5.治疗膀胱癌　在膀胱癌组织中，bFGF表达显著高于正常组织。bFGF可增强膀胱癌肿瘤微血管形成能力及肿瘤细胞增殖能力，bFGF异常表达是膀胱癌肿瘤生长快、恶性程度高、浸润深入易复发的重要因素之一［25，26］。实验表明bFGF抗体能够抑制肿瘤生长，这为今后膀胱癌治疗提供了新的途径［27］。

　　6.治疗神经胶质瘤　bFGF对来自神经外胚层和中胚层的细胞具有促有丝分裂作用，可促进细胞的增殖和血管的形成，其在人神经胶质瘤组织和细胞中高水平表达，可能与胶质瘤的进展有关［28，29］。Nemati等［30］应用抗bFGF免疫疗法，发现bFGF抗体在无胸腺裸鼠模型中抑制血管的发生和恶性神经胶质瘤的生长。Murai等［29］应用抗人bFGF中和抗体诱导神经胶质瘤细胞编程性死亡，这是治疗神经胶质瘤的一种很有前途的方法。

　　四、展望