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            LBA4404农杆菌感受态细胞的操作与应用！

一、背景

LBA4404农杆菌感受态细胞为Ach5型背景，核基因中含有筛选标签——利福平抗性基因rif，为了便于转化操作，此菌株携带一无自身转运功能的章鱼碱型Ti质粒pAL4404，此质粒含有vir基因(vir基因是T-DNA插入植物基因组必需的元件，pAL4404质粒自身的T-DNA转移功能被破坏，但可以帮助转入的双元载体T-DNA顺利转移)。pAL4404型Ti质粒含有筛选标签：strep，赋予LBA4404菌株链霉素抗性，适用于菸草、番茄、烟草等植物的转基因操作，经pCAMBIA2301质粒检测转化效率可达104cfu/μg。

二、操作说明

1、取-80℃保存的农杆菌感受态于冰上待其部分融化，处于冰水混合状态时插入冰中。

2、每100μl感受态加1μg(体积不大于10μl)质粒DNA，用手管底混匀，依次于冰上静置5分钟、液氮5分钟、28℃水浴5分钟、冰浴5分钟。

3、加入700μl无抗生素的LB或YEB液体培养基，于28℃振荡培养2~3小时。

4、6000rpm离心一分钟收菌，留取100μl左右上清轻轻吹打重悬菌块涂布于含相应抗生素的LB或YEB平板上，倒置放于28℃培养箱培养2-3天(当平板只含有50μg/ml kan时，28℃培养48h即可；平板中同时加入50μg/ml kan，20μg/ml rif时，需28℃培养60h；如果使用的平板含有50μg/ml rif则需要28℃培养72-90h)。

三、应用

用于HAL1基因转化烟草提高烟草耐盐性的研究：

利用基因工程手段培育能在盐碱地上种植的植物，是利用盐碱地的一条经济而有效的途径。HAL1基因是酿酒酵母中的重要耐盐因子，其表达参与调节细胞内离子浓度。尽管HAL1基因本身不是转运蛋白，但在盐胁迫下能与ENA1基因协同作用促进Na+外排，与其它转运系统协同作用增加K+的吸收，保持细胞内低的Na+/K+比，以减轻Na+毒害，因而在植物耐盐基因工程上具有很大的潜力。

首先将耐盐基因HAL1导入根癌农杆菌菌株LBA4404和C58C1中，然后用农杆菌介导的叶盘法将HAL1基因转入模式植物烟草，探索农杆菌介导的遗传转化条件及其影响因素，并对转基因烟草的耐盐性进行评价。

主要研究结果如下：

1、将含有目的基因的质粒ProkⅡ导入根癌农杆菌LBA4404和C58C1中。两个菌株均以70mmo/LCaCl2为转化溶液，OD600为0.5～0.6的YEB培养基制备的感受态细胞。

LBA4404感受态细胞和10ng质粒DNA于0℃共放置30min，液氮速冻5min,37℃热激5min时转化率,达1.4×105转化子/μgDNA。C58C1感受态细胞和20ng质粒DNA于0℃共放置10min，液氮速冻1min,37℃热激1min转化率，达1.33×105转化子/μgDNA。

2、以烟草为实验材料,建立了较为理想的再生体系。秦选1号以MS+6-BA 2.0mg/L+NAA0.4mg/L,秦烟95以MS+6-BA1.0mg/L+NAA0.1mg/L作为遗传转化时愈伤组织诱导及芽分化培养基。经Kan梯度筛选试验,以20mg/L和30mg/LKan分别作为秦选1号和秦烟95抗性芽的筛选浓度。以20mg/LKan作为两者转化植株生根时的筛选浓度。

3、优化了HAL1基因转化烟草遗传体系。取40～60d叶龄的秦选1号再生苗叶圆片不进行预培养,用携带目的基因的LBA4404农杆菌菌液稀释100×,浸泡1min来进行转化。外植体与农杆菌共培养2d后用灭菌蒸馏水充分冲洗，然后于2%的NaClO中浸泡15min,用灭菌蒸馏水冲洗4～5次,置800mg/L Cb+0.1%的甘露醇中浸泡约12h来进行除菌。采用早期筛选和后期筛选获得了Kan抗性植株。

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