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克隆 (电击) 感受态细胞的常规操作方法

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2024/12/9 11:03:34
TOP-10电击感受态细胞只能用于电击转化,不能用于热激转化。TOP-10来源于MC1061菌株,是目前实验室常用的感受态细胞之一,基因型与DH10B高度类似 (DH10B为galE15型,而 TOP-10为galU型)。 
操作说明:
一、0.1cm电击杯和杯盖从储存液中拿出倒置于干净的吸水纸上5分钟,待其沥干水分,正置5分钟,使乙醇充分挥发,待乙醇挥发干净立即插入冰中,压实冰面,电极杯顶离冰面 0.5cm以方便盖上杯盖,冰中静置5分钟充分降温。 
二、取-80℃保存的TOP-10电击感受态细胞插入冰中5分钟,待其融化,加入目的DNA (质粒或连接产物)并用手bo打EP管底轻轻混匀,避免产生气泡,立即插入冰中。
A.测定转化效率使用1μl 10pg/μl的对照质粒pUC19;  
B.对于连接产物,请用乙醇沉淀DNA后加入适量TE缓冲液(10mM TrisHCl,pH7.5;1mM EDTA)重悬,DNA浓度不超过100ng/μl,体积不超过5μl/50μl 感受态。 
三、用200μl枪头将感受态-DNA混合物快速移到电击杯中,避免产生气泡,盖上杯盖。 
四、启动电转仪,设置参数:C=25μF,PC=200Ω,V=1.8kV(此为BioRad电转仪推荐参数,也可按所用电转仪推荐的参数操作),将电击杯快速放入电转槽中,电击完成快速插入冰中。  
五、2分钟后从冰中取出电击杯,放室温,加入700μl不含抗生素的无菌S.O.C.培养基(室温),用1ml枪吹吸电击杯底部数次混匀后,转移到50ml离心管(BD Falcon50ml锥形离心管等),向离心管中补加S.O.C.培养基至5ml。37℃,225rpm 复苏60分钟。
六、5000rpm离心一分钟收菌,重悬后取100-200μl涂布到含相应抗生素的S.O.C平板上(因菌量较大,若全部涂板请选用直径15cm培养皿2-5个)。将平板倒置放于37℃培养箱过夜培养13-17小时。

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