机械负载成肌细胞的分泌组对体外肌腱细胞的影响

我们都知道，机械负荷可以改善肌腱愈合。承受负荷的愈合肌腱会变得强壮几倍，但其内在机制尚不*清楚。

细胞之间的分泌组串扰会诱导多种功能，例如细胞增殖、迁移、胶原蛋白生成和细胞分化。来自机械加载的肌肉细胞的分泌组已被证明含有增加水平的生长因子，如成纤维细胞生长因子 (FGF)，它可能与肌腱细胞表达的受体结合以改善愈合过程。这些表明肌肉分泌组可能会改善肌腱愈合。

已知机械负荷的临床变化对肌腱愈合有不同的影响。然而，不同的负荷方案是否会影响肌细胞分泌组，从而导致肌腱愈合的不同结果尚不清楚。

肌腱愈合过程包括三个重叠阶段：炎症、增殖和重塑。有研究发现大鼠骨髓间充质干细胞的分泌因子增强肌腱细胞的迁移和增殖，这表明肌腱细胞对来自其他密切相关细胞的分泌因子有反应。骨骼肌细胞的分泌组包含许多与迁移和增殖相关的生长因子和细胞因子。

在重塑阶段的后期，有一个由肌腱细胞产生的胶原蛋白I (Col I) 和少量的胶原蛋白III (Col III) 主导的更致密的结缔组织。因此，使用 Col I/III 的比值来分析肌腱愈合不同阶段的胶原蛋白成分。

肌腱细胞的分化有很多特征标志物。Tenascin-C (Tnc) 和波形蛋白 (Vim) 以及 Scx 是通常用于识别肌腱细胞的标志物。S100 钙结合蛋白 A4 (S100a4) 和 Alpha-Actin smooth muscle 蛋白（Acta2，也称为 α-SMA）是两个与肌腱愈合相关的标志物。有研究表明，表达 S100a4 的成纤维细胞与纤维化肌腱愈合呈正相关。CD146 (Mcam) 是肌腱干/祖细胞的标志物。因此，分析 Col I/III 比值和表型标记 Scx、Tnc、Vim、Acta2 和 S100a4 有助于理解肌腱愈合。

基于此，瑞典于默奥大学医学院综合医学生物学系、社区医学与康复学系的专家学者进行了深入研究，他们假设 (1) 来自成肌细胞的分泌组影响肌腱细胞和与肌腱愈合相关的参数，以及 (2) 不同的成肌细胞机械负荷方案在肌腱细胞中诱导不同的反应。

实验研究了与肌腱愈合相关的参数，包括 (i) 迁移、(ii) 增殖 (iii) 细胞表型和 (iv) 胶原蛋白生成。为了克服体内系统的复杂性，使用体外间接共培养系统，在成肌细胞存在的情况下培养肌腱细胞来测试假设，使用拉力系统机械加载成肌细胞。

根据初步数据，细胞在频率为 1Hz 的情况下接受 5% 的等双轴动态拉伸应变或着恒定的静应变。将细胞拉伸 1h，然后间隔 2h。重复此加载 3 次，然后间隔 4h。一个周期共耗时 13h。该方案重复试验 24h 或 48h。

静态负荷的成肌细胞的分泌组促进肌腱细胞迁移

实验首先检查了成肌细胞分泌组与机械卸载的成肌细胞共培养时对肌腱细胞迁移的影响。与单独培养的腱细胞相比，与肌腱细胞共培养的成肌细胞在 24h 后显著降低了肌腱细胞的迁移；然而，这种效果在 48h 后未见 。

接下来测试了成肌细胞的静态和动态负荷是否会影响肌腱细胞迁移。与卸载的成肌细胞相比，动态加载的成肌细胞在 24h 或 48h 不影响肌腱细胞迁移。然而，与未加载的成肌细胞相比，静态加载的成肌细胞在 24h 和 48h 都显著增强了肌腱细胞的迁移。

数据表明，相对于成肌细胞上的负荷类型，肌腱细胞迁移能力有不同的反应。此外，来自静态加载的成肌细胞的分泌组确实会诱导肌腱细胞的迁移。

机械加载的成肌细胞对肌腱细胞增殖和凋亡没有影响

实验使用 EdU 染色来量化肌腱细胞的增殖率。在 24h 和 4h 各组间未检测到增殖的显著差异。此外，在 48h 的蛋白质印迹中未发现增殖标记物增殖细胞核抗原 (PCNA) 的显著差异。

接下来使用乳酸脱氢酶 (LDH) 检测来量化肌腱细胞中的细胞死亡。24h 和 48h 各组间 LDH 水平无显著差异，表明没有诱导肌腱细胞的凋亡和/或坏死。蛋白质印迹进一步证实了这一结果，它显示 cleaved-Poly（ADP-ribose）polymerase（c-PARP）无显著差异，这是晚期凋亡活性的标志物。

机械加载成肌细胞的分泌组改变肌腱细胞的胶原蛋白表达

为了检测卸载或机械加载的成肌细胞是否影响肌腱细胞胶原蛋白的表达，实验测量了 mRNA 水平的 Col 1a1 和 Col 3a1 以及细胞内 Col I 和 Col III 的浓度，以及分泌到培养基中的浓度。结果表明，来自卸载的成肌细胞的分泌组在 mRNA 和蛋白质分泌水平上可以调节肌腱细胞中的 Col I/III 比值。

接下来，研究人员确定了不同的机械加载方案是否会影响共培养系统中的胶原蛋白生成。静态或动态加载成肌细胞24h后均未改变腱细胞中 Col 1a1 mRNA 的表达。相比之下，与动态和静态加载的成肌细胞共培养后，肌腱细胞中的 Col 3a1 mRNA 表达显著降低。机械加载的成肌细胞的分泌组没有改变细胞内的 Col I 含量。

与未加载的成肌细胞组相比，动态加载的成肌细胞组在 24h 时的培养基中 Col I 和 Col III 的浓度显著降低，静态加载的成肌细胞组在 48h 时的培养基中 Col I 和 Col III 的浓度显著降低。

总的来说，这些结果表明成肌细胞分泌组改变了培养基中 Col I 和 Col III 的浓度，成肌细胞的机械负荷改变了肌腱细胞中胶原蛋白的产生。