人成纤维细胞、平滑肌细胞和内皮细胞的共培养促进缺氧条件下骨桥蛋白的诱导-化工仪器网-手机版

肾功能衰竭是一个重大的公共卫生问题，发病率每年都在增加。终末期肾病患者需要肾移植或血液透析才能维持生命。动静脉内瘘（AVF）作为血液透析的血管通路。只有 50% 的 AVF 在创建六个月后仍保持功能，这增加了患者的发病率和死亡率。一些临床因素似乎与 AVFs 功能障碍有关，包括性别、年龄或糖尿病。组织学上，功能障碍最常见的原因是内膜增生（NH），它是狭窄的原因。在 AVF 的 NH 中已经确定了不同的机制，包括成纤维细胞分化为肌成纤维细胞、平滑肌细胞增殖和内皮细胞活化。

越来越多的证据支持 HIF 通路对影响血管壁的疾病（包括动脉粥样硬化，动脉瘤，肺动脉高压，血管移植失败，慢性静脉疾病和血管畸形）的发病机制的保护和破坏作用。此外，VEGF-A（一种 HIF-1α 靶基因）的表达增加可能通过增加平滑肌细胞的增殖而促成 NH。最近的一项研究表明，在 AVF 形成过程中降低 VEGF-A 基因表达会降低 NH。

骨桥蛋白（OPN）是一种 SIBLING 蛋白（小整合素结合配体 N 端连接糖蛋白），最初被鉴定为将骨细胞与细胞外基质连接起来的骨基质蛋白。OPN 有两种亚型，即分泌型（sOPN）和胞内型（iOPN），它们具有不同的生物学功能。OPN 参与多个过程，包括组织重塑、细胞免疫调节、病理性慢性炎症过程、癌变以及心血管疾病。特别是，已发现它在人再狭窄性血管病变和狭窄性血管病变的血管平滑肌细胞中表达。

活性氧（ROS）和高血糖在胰腺上皮细胞和血管平滑肌细胞中诱导 OPN 的体内表达。尽管已显示缺氧状态时 OPN 的上调依赖或独立于 HIF-1 的调控，但 OPN 表达在缺氧条件下通过不同的机制增强，导致与 VEGF 共表达。

鉴于氧浓度的变化发生在 AVF 的手术创建过程中与 OPN 过表达同时发生，法国蔚蓝海岸大学、法国尼斯大学中心医院血管外科、摩纳哥科学中心的课题组认为 OPN 是由缺氧诱导的，因此可能由于 NH 和近端吻合口狭窄而导致 AVF 成熟失败。他们假设通过沉默 HIF 或 NF-kB 来调节 OPN 可以促进 AVF 成熟。最后还描述了一种体外共培养细胞模型，该模型在缺氧条件下诱导 OPN，但仅在细胞-细胞相互作用的条件下。

在缺氧细胞中不诱导细胞内 OPN（iOPN）

首先，实验评估了 AVF 患者中 OPN 的表达水平。与对照静脉相比，AVF 中 OPN mRNA 的表达（图1 A）和 OPN 免疫反应性（图1 B）均显著增加，证实了之前的结果以及 OPN 在 AVF 成熟中的潜在作用。

然后在不同的细胞模型中通过免疫印迹对 iOPN 进行表征。重组 OPN（recOPN）用于定量表达（图1 C）。人骨髓间充质细胞成骨细胞（图1 D）和 LNCap 细胞（图1 E）作为对照进行检查，因为这两个模型已知表达 OPN。针对 OPN 的抗体检测到的 recOPN 浓度为 50 和 16.6 ng，相对分子量为 70 kDa（图1 C）。人骨髓间充质细胞和成骨细胞在培养 48 小时后在常氧环境中显示出 iOPN 的高表达。

由于 iOPN 在 LNCaP 中表达，评估了这些细胞中 iOPN 的潜在缺氧诱导，并观察到了轻微的诱导（图1 E）。由于 HIF-1 是细胞适应缺氧的关键蛋白，实验检查了 HIF-1 是否参与 iOPN 的诱导。使用 siRNA 沉默 HIF-1α，发现在没有 HIF-1α 的情况下，iOPN 表达仍然存在。只有 OPN 应用 siRNA#2 *消除了 iOPN 的表达。

随后的实验是用这种 siRNA 对 OPN 进行的。NHF（代表外膜；图1 F），HUVSMC（代表与弹性纤维相关的平滑肌细胞；图1 G）和 HUVEC（代表内皮细胞；图1 H），对构成动脉和静脉三层的三个细胞系进行了 iOPN 表达测试。尽管在缺氧条件下（1% O2 48 小时）检测到 HIF-1α 和 HIF-2α ，但这些细胞均未表达 iOPN。这些细胞在常氧或缺氧的 0.2% O₂ 中均不表达 iOPN。用siRNA 转染 NHF（图1 F）、HUVSMC（图1 G）和 HUVEC（图1 H）后，HIF-1α 和/或 HIF-2α 大大减少了这两个亚基的数量，而 HIF-1α 的沉默略微增加了 HIF-2α 的检测水平，反之亦然。因此沉默了两个亚基来*消除 HIF 的活性。

这些结果表明在 NHF 中，iOPN 表达低于 16.6 ng 的可检测水平（图1 C），而在 HUVSMC 和 HUVEC 中弱表达。

图1 骨桥蛋白（OPN）在 NHF、HUVSMC 和 HUVEC 中弱表达，并且在缺氧时不被诱导。

在缺氧细胞中不诱导分泌型 OPN（sOPN）

然后，实验使用 ELISA 测试了这些细胞中的 sOPN。使用两种不同的试剂盒，一种以纳克为单位测量 sOPN（图2 A），一个以皮克为单位（图2 B）。当使用 recOPN 作为参考时，在常氧或缺氧或 H₂O₂ 或葡萄糖等可能诱导 OPN 的条件下在纳克水平下 NHF、HUVSMC 和 HUVEC 中未检测到 sOPN（图2 A）。

更灵敏的试剂盒检测在 NHF 中（图2 B）、HUVSMC（图2 C）中检测到 sOPN，但不在 HUVEC （图2 D）。HNF 和 HUVSMC 在常氧环境中的 sOPN 水平相似，分别为 765 和 1060 pg/mL。SiRNA OPN（siOPN）用作对照，消除了 OPN 的分泌。然而，没有已知的增加 OPN 的刺激物在常氧环境中激活 sOPN。缺氧条件不会增加 sOPN，并且 HIF-1α 和/或 HIF-2α 的沉默不会阻止 NHF 和 HUVSMC 中 OPN 的分泌。然而，用特异性抑制剂（IKK2（AS602868）抑制剂，iNF-κB ）会轻微抑制 NF-κB 活性，但在统计学上 OPN 的分泌从 850 pg/mL 降低到 700 pg/mL。

这些结果证实了两种 iOPN 的弱表达（图1）和这些细胞中的 sOPN，并表明在 HUVEC 中未检测到 sOPN。实验还证实，这两种形式在缺氧条件下不会通过 HIFs 诱导。然而表明 NF-κB 在一定程度上参与了 OPN 的调控。

图2 与缺氧相比，在常氧下由 NHF、HUVSMC 和 HUVEC 产生 OPN。

共培养有利于缺氧条件下 OPN 的诱导

最后，鉴于 OPN 和 AVF 之间的潜在联系已在小鼠模型的成熟过程早期显示，其中三层细胞并列，实验使用不同的组合共培养细胞：NHF/HUVSMC、NHF/HUVEC、HUVSMC /HUVEC 和 NHF/HUVSMC/HUVEC（图3）。NHF、HUVSMC 和 HUVEC 中 OPN 的 mRNA 表达高于 NHF/HUVSMC、NHF/HUVEC、HUVSMC/HUVEC 和 NHF/HUVSMC/HUVEC 共培养物（图3 A）。HUVSMC/HUVEC 的共培养明显增加了 OPN 的表达水平。然后，与对照 siRNA 或 siOPN 相比，在 siRNA 不存在或存在的情况下量化了 OPN 在常氧和缺氧中的内源性表达（图3 B）。暴露于缺氧的 NHF/HUVSMC 和 NHF/HUVEC 的共培养显示 OPN 表达增加了两倍。HUVSMC 和 HUVEC 的细胞间相互作用显示出 OPN 的基础表达量高，是其他缺氧共培养中 OPN 的 16 倍，而其他共培养物在缺氧时未发现诱导。最后，所有细胞类型一起呈现中间表达，在常氧条件下四倍诱导，但在缺氧条件下仍然没有诱导。

因此，使用 ELISA 测量了不同组合中的 sOPN（图3 C）。在所有共培养组合中，观察到缺氧条件下 sOPN 的诱导。此外，与没有 HUVEC（NHF/HUVSMC，1.5 倍诱导）的组合相比，HUVEC 与 NHF（2.3 倍诱导）、HUVSMC（2.7 倍诱导）或 NHF/HUVSMC（2.4 倍诱导）的组合似乎在缺氧时刺激更多的 sOPN 诱导（NHF）。最后，发现 OPN 下调不会改变 NHF、HUVSMC 和 HUVEC 的细胞增殖，而重组人 OPN 只会增加 HUVEC 增殖（图3 D），表明 HUVEC 细胞对 OPN 敏感并且可以直接促成病理性 NH 的发生。

这些结果强烈表明，在没有细胞间相互作用的情况下，OPN 表达不会在缺氧条件下被诱导。此外，不表达 OPN 的 HUVEC 细胞是 NH 过程的核心。

图3 共培养在缺氧条件下诱导 OPN 表达。

总之该研究表明，在 AVF 成熟期间发生的氧合变化可能通过内皮细胞或至少通过形成 AVF 的不同细胞层的细胞间相互作用上调 OPN 的分泌，进而增加炎症并促进内皮细胞增殖。

参考文献：Sadaghianloo N, Contenti J, Dufies M, Parola J, Rouleau M, Lee S, Peyron JF, Fabbri L, Hassen-Khodja R, Pouysségur J, Bost F, Jean-Baptiste E, Dardik A, Mazure NM. Co-culture of human fibroblasts, smooth muscle and endothelial cells promotes osteopontin induction in hypoxia. J Cell Mol Med. 2020 Mar;24(5):2931-2941. doi: 10.1111/jcmm.14905. Epub 2020 Feb 7. PMID: 32032472; PMCID: PMC7077551.

图片来源：所有图片均来源于参考文献

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人成纤维细胞、平滑肌细胞和内皮细胞的共培养促进缺氧条件下骨桥蛋白的诱导

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