WB实验的步骤较多,耗时均较长,且每步都影响其结果表现。我们将常见问题总结归纳,下面将对各问题进行分类总结,并对出现该现象的原因进行分析,给出相应的解决办法。
无信号,没有阳性条带
WB实验结果中常出现白板或者条带无信号响应现象,我们针对出现该现象可能的原因主要从抗体,抗原,实验操作和缓冲液几方面进行分析。
1、抗体相关原因:
WB中所用到抗体包括一抗和二抗,在该问题上,两个抗体方面可能存在的原因以及相对应的解决方法。
解决办法:二抗选用不恰当,选择与一抗相匹配的二抗类型,二抗需和一抗宿主的物种相同。无足够量抗体结合目标蛋白,降低一抗稀释度;使用效价高的一抗;延长抗体孵育时间;膜充分浸润在液体中。
2、抗原相关原因
抗原即所需要检测目的蛋白,其相关原因可能是未被一抗识别或者是抗原量不足引起。
解决办法:一抗不识别待检测的目的蛋白,参照数据库对比抗原序列和蛋白序列,选择合适一抗,确保会发生特异性反应,抗原量不足或降解,每条泳道上样量不低于20~30ug,使用蛋白酶抑制剂并设置阳性对照。
实验操作规范对于实验结果也至关重要,且需要重复摸索。无条带出现可能是目标蛋白未从胶转移至膜上或者洗膜过度。
WB实验结果中可能出现有目标蛋白条带,但是目标条带在膜上颜色较浅。该现象原因与无目标条带较为相似,可能导致该现象的原因我们也从4个方面进行分析,并给出相应的解决方法。