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夹心法ELISA操作步骤

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2023/2/24 10:12:31


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操作步骤


1

分别设定标准孔、0孔和样本孔,计算好当次试验所需要的板条数量,将不需要的板条拆卸下来,用新的封板膜重新封好,放回装有干燥剂的铝箔袋。

2

浸泡酶标板:加入300 μL 1×洗涤液静置浸泡30秒,弃掉洗涤液之后,在吸水纸上将微孔板拍干,重复2次。

提示:洗板完成之后,请立即使用微孔板,不要让微孔板干燥。

3

加标准品:标准品孔加入100 μL的2倍倍比稀释的标准品。0孔加入100 μL标准品/样本稀释液。

4

加样本:样本孔加入100 μL的待测样本。保证连续加样,不要间断。加样过程在10 min内完成。

5

孵育:使用新的封板膜封板。37℃静置孵育90 min。

6

洗涤:弃掉液体,每孔加入300 μL洗液洗板,洗涤4次。每次洗板,在吸水纸上拍干。

提示:为获得理想的实验结果,必须干净移除残留液体。洗板完成之后,请立即进行下步操作,不要让微孔板干燥。

7

加生物素化检测抗体:加入100 μL生物素化抗体工作液至反应孔中。

8

孵育:使用新的封板膜封板。37℃静置孵育60 min。

9

洗涤:弃掉液体,每孔加入300 μL洗液洗板,洗涤4次。每次洗板,在吸水纸上拍干。

提示:为获得理想的实验结果,必须干净移除残留液体。洗板完成之后,请立即进行下步操作,不要让微孔板干燥。

10

加酶结合物:加入100 μL酶结合物工作液至反应孔中。

11

孵育:使用新的封板膜封板。封板后于37℃静置孵育30 min。

12

洗涤:弃掉液体,每孔加入300 μL洗液洗板,洗涤5次。每次洗板,在吸水纸上拍干。

提示:为获得理想的实验结果,必须干净移除残留液体。洗板完成之后,请立即进行下步操作,不要让微孔板干燥。

13

加底物显色:每孔加入100 μL显色底物TMB,避光,37℃避光显色15 min。

提示:可根据实际显色情况酌情缩短或延长显色时间,但不可超过30 min。当标准孔颜色出现明显梯度时(标准孔的前4孔出现明显的蓝色梯度,后3~4孔不明显),即可终止。提前15 min打开酶标仪预热。

14

加终止液:每孔加入50 μL终止液,终止液加入的顺序应尽量与显色底物加入的顺序相同。

提示:终止液加入后微孔板内液体的颜色由蓝色变为黄色。如果颜色呈现绿色或者颜色的变化明显不均匀,请轻轻叩击板框,水平充分混匀。

15

检测读数:在5 min之内,使用酶标仪进行双波长检测,测定450 nm最大吸收波长和630 nm参考波长下的OD值。

提示:校准后的OD值为450 nm的测定值减去630 nm的测定值。(注:630 nm OD值为酶标板材质吸收值。若不能进行双波长检测,可只测定450 nm波长下的OD值,但数据的准确度会降低一些)


注意事项:

检测之前请将所有的试剂、样本平衡至室温。

样本复融后若有沉淀,需再次离心,取上清检测。

试剂或样本配制时,需充分混匀并尽量避免起泡。

标曲和样本建议做复孔检测。

检测实验操作前,准备好所有需要的试剂及工作浓度的标准品。



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