青光眼是一种视神经丨 病变，约6000万人受到影响，是目前导致不可逆失明的最常见疾病之一。高眼压导致的视网膜神经节细胞(RGCs)丢失、轴突变性与青光眼发病的机制有关，青光眼视神经丨病变除了高眼压外还与其他多种因素相关。目前，青光眼的药物治疗仅限于降眼压剂;因此，为了保护RGCs免受有害因素影响，急需新药研发。为了加快青光眼药物的研发，有必要研究青光眼的病理生理和分子机制。G蛋白偶联受体3 (GPR3)可促进神经轴突生长和神经元存活，然而，GPR3在视神经元损伤后轴突再生中的潜在作用尚未阐明。
为了弄清该病的病理及其分子机制，日本广岛大学的研究人员研究了小鼠视网膜损伤后GPR3在小鼠RGCs中的表达及参与的轴突再生机制。研究团队在国际科学期刊Neurobiology of Disease上发表了题为“GPR3 expression in retinal ganglion cells contributes to neuron survival and accelerates axonal regeneration after optic nerve crush in mice ”的文章，研究表明，GPR3在RGCs中的表达有助于维持小鼠视神经挤压（ONC）后神经元的存活并且联合酵母聚糖处理可进一步增强再生轴突的作用。
神经元损失是由损伤后细胞内cAMP下调引起的，cAMP下调降低了特定神经营养因子的反应性，从而导致RGCs死亡。GPR3在各类神经元中均有表达，特别之处在于它在没有配体的情况下激活Gαs蛋白，从而增加细胞内基础cAMP水平。cAMP的升高可以增强由酶母聚糖、肿瘤调节素或神经营养因子诱导的轴突再生。因此，细胞内cAMP升高对神经元存活与生长具有多模式影响并对轴突损伤后神经元再生具有重要作用。由于视网膜免疫染色需要强渗透处理，因此，作者利用CRISPR- Cas9基因组编辑技术生成了PA标记的GPR3转基因小鼠。制备crRNA-tracrRNA复合物，然后将Cas9酶、crRNA-tracrRNA和ssodn以100、200和400 μg/μl的最终浓度混合。使用NEPA 21（NEPA GENE）电转染仪将Cas9酶、gRNA和ssodn的混合物转染到小鼠胚胎中以便观察GPR3在视网膜上的分布与表达情况。结果显示视网膜中，GPR3在RGCs、ONL和INL神经元中均表达，在无分泌细胞中表达稀疏。视网膜中GPR3的表达与中枢神经细胞中GPR3的表达趋势相似（图1）。
图1、GPR3在小鼠视网膜中具备高表达
为了研究GPR3在RGC存活过程中的作用，通过评估RGCs数量和内网织层（IPL）厚度来确定RGC活力。与野生型小鼠相比，早在10-12周龄时，GPR3敲除小鼠的RGCs数量和IPL厚度显著减少。在野生型小鼠中，与10-12周龄相比，50-60周龄时RGCs数量明显减少。此外，在50-60周龄的GPR3敲除小鼠中也观察到RGCs数量的减少。这些结果表明，GPR3在RGC中的表达与RGC在衰老过程中的生存有关，但对眼压无影响（图2）。
为了包装腺相关病毒（AAV）， PAAV质粒、Rep2-Cap2质粒和phelper质粒使用NEPA21电转染仪(Nepa Gene)共转染HEK293FT细胞，从细胞和培养基中收集包装好的AAV载体，然后进行纯化。为增加载体浓度，将复合材料应用于Vivaspin色谱柱(VS2041;感染前1天，HEK293细胞以2.0 × 105个细胞/孔的比例在24孔板中培养，以评估滴度。转染3天后固定细胞，在荧光显微镜下计数gfp阳性细胞，每种AAV的效价分为三份并计算转导单位(TU/ml)，得到本研究使用的AAV病毒滴度:rAAV-Mock 10 × 1010 TU/ml和rAAV-GPR3 8 × 1010 TU/ml。为了评估轴突再生，6周龄雄性野生型小鼠(C57BL/6)在ONC前2周使用玻璃拉杆制成的尖尖玻璃毛细管静脉注射1 μl rAAV-Mock或rAAV-GPR3。为了评估GPR3和酵母聚糖的联合作用，在ONC后立即仔细地静脉注射1 μl酵母聚糖 。阳性对照组在ONC后立即同时注射1 μl 酵母聚糖。摘除眼睛，在去核前两天，顺行示踪剂以可视化再生的RGC轴突。然后用低温恒温器将固定的视网膜矢状切片成14 μm厚的切片，为了评估再生轴突的数量，作者在距离粉碎部位4种不同距离处量化再生轴突的数量。对野生型或GPR3基因敲除小鼠的眼睛进行ONC，手术后立即在眶内给药酵母聚糖，神经损伤后28天用荧光顺行示踪剂评估轴突再生。结果表明，在野生型小鼠中，酵母聚糖影响轴突再生。然而，在GPR3基因敲除小鼠的视网膜中，酶多糖介导的轴突再生被显著抑制。当联合酵母聚糖时，GPR3在ONC后轴突再生中起作用（图3）。
图3、GPR3参与视神经挤压（ONC）后的轴突再生
基于其他报道称暴露于各种缺血刺激后，GPR3参与CGNs神经轴突生长和神经元存活。因此，为了确定GPR3表达是否在RGCs的神经突生长和神经元存活中发挥类似的作用。RGCs在培养前表现出微弱的GPR3表达;然而，直到培养7天，GPR3的表达逐渐增加(图4.A-B)，这与原代培养的CGNs中GPR3的表达趋势相似。当GPR3表达为与对照组相比，siRNA抑制RGCs中GPR3的表达显著降低(图2.A).在对照组siRNA处理的RGCs中，神经突出增加，直到培养48小时。然而，当GPR3 siRNA抑制了固有的GPR3表达时，RGC神经突在培养24或48小时被显著抑制(图4.C-D)。此外，与对照组siRNA处理的RGCs相比，在培养24或48小时，GPR3 siRNA处理的RGCs的RGC存活率显著降低(图4.G-H)。
相反，当用表达GPR3的载体转染RGCs时，GPR3的表达与模拟载体转染RGCs相比显著增加。与模拟转染的细胞相比，GPR3表达载体转染的RGCs中的神经突显著增加这些结果表明，GPR3在培养的RGCs中的表达促进了神经突的生长和神经元的存活（图4）。
图4、GPR3参与小鼠原代培养RGCs的神经突起生长和神经元存活
作者认为GPR3基因转染到视网膜联合酵母聚糖治疗可显著刺激轴突再生，类似于cAMP联合酵母聚糖治疗后观察到的情况。cAMP升高对生长因子有增敏作用，并影响PKA-、ERK-和pi3k依赖的信号通路。因此，本研究观察到GPR3对酵母聚糖的增敏作用可能是通过GPR3下游信号通路介导的。同时，Akt介导的信号通路对轴突再生具有多种影响，下调SOCS3或PTEN抑制剂可激活PI3K-Akt信号通路，从而增强ONC后的轴突再生。此外，轴突退变受Akt信号的调控，Akt信号的增强可以抵消多巴胺能轴突的逆行退变。同时CaMKII-CREB信号通路对于ONC后神经元存活和轴突再生很重要。因此，损伤后RGCs轴突再生涉及多条信号通路，有趣的是，当GPR3在CGNs中表达时，它可能激活多个下游信号通路。因此，GPR3激活与轴突再生相关的多条信号通路是视网膜轴突再生的可行机制。此外，GPR3可以在不添加配体的情况下维持cAMP的基础水平。在目前的研究中，在ONC后4周，GPR3转导细胞的轴突再生比 cAMP联合酵母聚糖治疗的细胞少。然而，GPR3对ONC后4周以上轴突再生的长期影响尚不清楚。
NEPA 21（NEPA GENE）电转染仪在本研究中发挥了至关重要的作用，作者通过CRISPR-Cas9基因组编辑系统并使用NEPA 21电转染仪获得了PA-GPR3敲入小鼠，采用纯合子PA-GPR3转基因小鼠，用抗PA抗体进行视网膜中GPR3表达的免疫染色分析，从而确定了GPR3在视网膜中的分布及表达情况。为了包装AAV, PAAV质粒、Rep2-Cap2质粒和phelper质粒使用NEPA 21电转染仪共转染HEK293FT细胞，获取到AAV载体，然后进行浓缩和纯化，为后续的确定轴突再生实验提供了良好的病毒载体。
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原文：
doi. org/10.1016/j.nbd.2022.105811.
参考文献：
1、Benowitz, L.I., et al., 2017. Reaching the brain: advances in optic nerve regeneration.
Exp. Neurol. 287, 365–373.
2、Boczek, T., et al., 2019. Regulation of neuronal survival and axon growth by a
perinuclear cAMP compartment. J. Neurosci. 39, 5466–5480.
3、Bonne, C., et al., 1998. Free radicals in retinal ischemia. Gen. Pharmacol. 30, 275–280.
4、Buckingham, B.P., et al., 2008. Progressive ganglion cell degeneration precedes neuronal
loss in a mouse model of glaucoma. J. Neurosci. 28, 2735–2744.
5、Cavet, M.E., et al., 2014. Nitric oxide (NO): an emerging target for the treatment of
glaucoma. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 55, 5005–5015.
6、Cheng, H.C., et al., 2011. Akt suppresses retrograde degeneration of dopaminergic axons
by inhibition of macroautophagy. J. Neurosci. 31, 2125–2135.
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