激光扫描共聚焦显微镜（K1-Fluo）在光学显微镜的基础上结合了激光和计算机图像处理技术，把光学显微镜的分辨率提高了30-40%，其光学切片能使观察组织，细胞的三维结构成为可能。本文着重介绍了共聚焦显微镜在生物学领域的应用，样品的三维定量测量，活细胞的动态信号监测并探讨了激光共聚焦显微镜子啊生物学的应用前景。
与传统的光学显微镜相比，激光共聚焦显微镜(K1-Fluo)能提供高清晰的三维图像，在材料学（半导体工业），地质学，医学和生物学等领域中有着广泛的应用。
生物用共聚焦显微镜大多是在荧光显微镜成像的基础上,以紫外线可见激光激发荧光物质,得到细胞或组织内部微细结构的荧光图像。不同的结构有各自性的荥光染料 ,有些甚至可以在活细胞上非创伤性地进行染色,在亚细胞水平上观察诸如 CapH、膜电位等生理信号及细胞形态的动态变化 ,特别是在结合了先进的生物学技术以后,更成为药理学，形态学，细胞生物学，神经科学，研究中强有力的新一代研究工具。下文引述的共聚焦显微镜均以生物用荧光共聚焦显微镜为例。
2.传统荧光显微镜的不足
使用荧光物质标志细胞中的特定结构,不仅图像与背景的对比度增强.而且由于许多荧光显微镜的光源使用短波长的紫外光,大大提高了分辨率(8=0.61 入/NA其中6为显微镜的分辨率入为照明光线的波长 ;NA 为物镜的数值孔径)。但当所观察的荧光标本稍厚时,传统光显微镜一个难以克服的缺点就显现出来:焦平面以外的荧光结构模糊、发虚。原因是大多数生物学标本是层次区别的重叠结构(如耳蜗基底膜.其实是外毛细胞、多种支持细胞神经纤维等组成的空间结构).在普通光学显微镜下聚焦平面的变化,会表现出不同的形态。假若荧光标记的结构在不同层次上都有分布,且重叠在一起反射荧光显微镜(epifluorescent microscope)不仅从焦平面上收集光量而且来自焦平面上方 或下方的散射荧光也被物镜所接收.荧光显微镜的光学分辨率就要大大降低。
3. 共聚焦显微镜的成像原理及技术
共聚焦显微镜成功地解决了上述问题，只有焦平面上的点才得到探测。它采用点光源(point lightsource)照射标本,在焦平面上形成了一个轮廓分明的小的光点(light spot),该点被照射后发出的荧光被物镜收集并沿原照射光路回送到由双向色镜构成的分光器(beam splitter)。分光器将荧光直接送到探测器。光源和探测器前方都各有一个针孔(pinhole).分别称为照明针孔和探测针孔。二者的几何尺寸一致,约 0.1~0.2m;相对于焦平面上的光点。二者是共辄的,即:光点通过一系列的透镜 最终可同时聚焦于照明针孔和探测针孔。
这样,来自焦平面的光,可以会聚在探测针孔范围之内,而其它来自焦平面上方或下方的散射光,都被挡在探测针孔之外而不能成象。以激光逐点扫描样品,探测针孔后的光电倍增管也逐点获得对应光点的共聚焦图像,转为为数字量传输至计算机 最终在屏幕上聚合成清晰的整个焦平面的共聚焦图像。每一幅焦平面图像实际上是标本的光学横断面,这个光学横断面总是有一定厚度的,又称之为光学薄片(Optical slice)。共聚焦显微镜光学分辨率及其光学薄片厚度,与光的波长有关,也取决于物镜的数值孔径和针孔的直径。如果探测器的针孔较大,光学薄片即变得较厚,那么所获得的图像与传统的荧光显微镜无异。
以一个微动步进马达(最小步距可达 0.1m)控制载物台的升降使焦平面依次位于标本的不同层面上,则可以逐层获得物体光学横断面的图像,这称为“光学切片”(Optical sectioning)。获得真正意义上的标本的三维数据,可以利用多种计算机图像处理及三维重建软件,沿 xy 轴或其它任意角度来表现标本的外形剖面,十分灵活、直观进行形态学观察
4. 共聚焦显微镜地生物学应用
4.1 细胞，组织的三维观察和定量测量
扫描电镜已在观察细胞超微结构的三维图像方面获得极大的成功,其分辨率是光镜(包括共聚焦显微镜)所不可比拟的。但其样本的制备过程相对复杂,所需的设备条件要求较高,并可能造成某些结构的缺失或改变。共聚焦显微镜的分辨率超过普通光镜.染色过程简便.甚至可以在活细胞上进行无创伤性的染色,维持细胞的正常形态。多种特异性的荧光染料 如AO (Acridine orange)、PI (Propidium iodide)、DAPI, Rhodamine、鬼笔毒环肽(Phalloidin)和DiI等,已被广泛地用于诸如 RNA,DNA细胞核、线粒体、内质网、肌动蛋白、细胞膜等结构的标记。运用免疫荧光技术,将不同波长 的两三种荧光物质标记在内部不同结构的相应抗体上,以这几种荧光物质特定的光谱特性选择激发光和滤光片 ,则可以观察到细胞内部各结构的间毗邻关系。特别是在荧光着色点较小易被遮盖(如荧光原位杂交实验)的情况下,这种三维图像的多角度观察提供了极大的*性
细胞有丝分裂中细胞核内染色体数目(双倍体、多倍体)、形态和位置的变化.一直是细胞生物学肿瘤研究中的热点。着丝点是细胞核内的重要结构被认为在有丝分裂中起重要的作用,应用共聚焦显微镜的定量测量技术,可以较精确地测定着丝点在不同分裂期的位置。
共聚焦显微镜生成厚度小于 0.2 微米的依次相连的光学切片 .使较厚的组织的三维数据也可被计算机获取,运用适当的图像分析软件 .可以测量并确定所观察结构的表面特征,体积等参数,为三维定量测量提供了新手段。
4.2 活细胞生理信号的动态监测
活细胞的功能监测在细胞生物学、神经生理学、药理学等领域都有重要意义。许多荧光染料可以聚集在细胞的特定结构,而对细胞的活性基本上不产生影响。可以利用这一特性来反映细胞受到刺激后形态或功能的改变。如亲脂性染料 DiOC6主要聚集在内质网(Endoplasmic reticulum,ER),且对细胞的毒副作用极小。肌细胞中的肌浆网(Sarcoplasmic reticulum,SR)与 ER 有相同的属性,是胞内钙库,应用共聚焦显微镜,就可以动态观察肌细胞兴奋时 SR 的变化。
神经生理学家多年来一直期望能直接用肉眼观察到神经通路的兴奋传导,应用共聚焦显微镜就可观察用电压敏感性染料或离子敏感性染料着色的脑片深层神经元动作电位的传导或与其伴随的离子的进出。从而为神经回路、神经网络的研究提供了第一手的资料。
总之.共聚焦显微镜利用荧光染料,从形态和功能两个方面为生物学研究提供了崭新技术手段。
5. 共聚焦显微镜的未来-激光细胞仪
共聚焦显微镜是以激光作为光源的，利用紫外或可见激光的生物学效能，可以进一步发展成激光细胞仪。
5.1 粘附细胞的分选
流式细胞仪可以实现游离细胞分选，如鉴别出二倍体和多倍体细胞。激光细胞仪则可能对贴附在培养皿底部的粘附细胞进行分选。将细胞贴壁培养在特质培养皿上，培养皿底部有一层特殊的膜,用高能量激光在欲选细胞四周切割成八角形几何形状.掀去培养皿底部的膜.非选择细胞则被去除。该分选方式特别适用于选择数量极少的细胞.诸如突变细胞、转化或杂交癌细胞。另一种细胞分选的方式是用高能量激光自动杀灭不需要细胞留下完整的活细胞亚群继续培养,这种方式适于对数量较多的细胞的选择。
5.2 细胞激光显微外科
可把激光作为一把“光子刀”，实现诸如细胞膜瞬间穿孔，线粒体或溶酶体等细胞器烧灼，染色体切割，神经元凸起切除等一系列细胞“外科手术”。
5.3 光镊
光镊是利用激光的力学效应,将一个微米级大小的细胞器或其它结构钳制于激光束的焦平面上,也称为光陷阱(optical trap)。其原理,激光从上方进入显微镜的物镜.光束内聚在焦平面上形成光束狭部(beam waist),产生三维的光强梯度个微米级的物体就可被陷阱捕获。显微镜的照明光线来自下方的聚光器
光镊可以用来进行细胞融合(如卵细胞受精)、机械刺激或细胞骨架弹性测量等.特别是在测量植物细胞的细胞骨架时很有意义),因为植物有一层厚硬的细胞壁,不能像动物细胞那样利用微操纵器对原生质膜进行机械处理。
5.4 笼锁化合物
现在许多重要的生物活性物质(神经递质、细胞内第二信使)都有其笼锁化合物合成)，如 Ca2的笼锁化合物)主要有 Nitr - 5,DM -nitrophen。在笼锁(caged)状态下,其功能被封闭,一旦被特异波长(一般为紫外)的瞬间照射后.即被光活化而解笼锁(uncaged),快速地恢复原有的活性和功能。这种方法提供了一种在时间和空间上可控的生物活性产物或其它化合物释放的有效方法。
5.5 光漂白后的荧光恢复
FRAP 技术借助高强度脉冲式激光照射细胞的某一区域,从而造成该区域荧光分子的光淬灭,该区域周围的未淬灭的荧光分子将以一定速率向受照区域扩散,而此扩散速率可通过低强度激光扫描探测。在研究细胞骨架构成、跨膜大分子迁移率细胞膜流动性、胞间通讯等领域中有较大的意义
6. 结语
共聚焦显微镜对光学显微镜的成像原理作了改进，可进行细胞内部结构的三维观察和测量，同时又可以监测许多生理信号的动态变化，特别是结合激光生物学的研究手段，在整个生物学研究领域都有着广阔的前景。
