科普小课堂|特染结果与数据分析

组织切片的特殊染色结果图可以显示组织中的特定物质或结构，通常使用拍照或目测的形式进行对比和判别，但是想要更直观的分析比较或者让结果在文章里更有说服力就需要对染色结果图进行定量或半定量的取值分析。目前SCI高分文章常用的两种对特殊染色结果图进行定量分析的方法如下：

通过洗脱进行半定量分析方法的关键环节在于找到一种特异性洗脱阳性染料而不洗脱其他染料的洗脱剂，索莱宝的染色试剂盒可用于洗脱阳性染料后半定量分析的产品包括钙盐的茜素红染色、酸性糖蛋白的阿利新蓝染色、中性脂质的油红O染色和胶原蛋白天狼星红染色等等。洗脱测定法对样本大小，染色状态和洗脱体积要求较高，通常只用于细胞样本的结果进行定量分析。

茜素红染色（G1452/G3280/G3281）：茜素红常用来指示骨组织或者骨细胞中的钙盐，标记为红色，洗脱时需要用到10%的十六烷基吡啶（C9890）溶液。以骨细胞为例，细胞应按照适宜的浓度在96孔板中培养，按照正常程序染色骨细胞中的钙盐，染色之后用蒸馏水冲洗干净，将蒸馏水甩干后加入洗脱液孵育足够的时间使结合在细胞上的茜素红充分洗脱，最后检测洗脱溶液的吸光度值，茜素红的检测波长为562nm。

油红O染色（G1260/G1261）：油红O染色常用来指示各种组织中的脂肪堆积，与传统的苏丹染料相比，油红O可以显示组织中更微小的脂滴并将脂滴染色为红色，油红O洗脱常用的溶剂为100%异丙醇。培养的脂肪细胞或者是有脂肪沉积的组织按照说明书的步骤染色后，用60%异丙醇稍洗去除非阳性着色，用100%异丙醇洗掉阳性油红O染料，在490nm处测定吸光度值对染色结果进行取值分析。

其他具有类似性质的染色方法也可以通过查阅资料找到合适的洗脱溶剂、洗脱时间和检测波长来进行取值分析，具体流程可参考茜素红和油红O染色。

图像处理法要比吸光光度法对实验要求更低，适用的范围更广（包括细胞结果和切片结果，常规染色、特殊染色、免疫组织化学染色和免疫荧光均可应用），但是对成像的要求更高，要求取景定位和成像条件尽量一致。对于批量实验结果的处理更便捷。

图像处理软件量化阳性区域面积或者光密度值的方法如下：

（1）在Image J或IPP软件中打开需要量化的图片

（2）染色结果选择Image—Type—RGB Stack（操作完成之后下方滚动条可以选择特定颜色）

（3）阈值调整，手动选择出所需的色彩范围

（4）读取灰度值或将灰度值转换为光密度值

（5）选择检测内容，一般应选择面积、灰度值（此时可转换为光密度值）、阳性面积百分比和检测选中区域等选项（其中光密度值/面积即为平均光密度值）

（6）数值检出（可以选择整张图片检出，也可以选择图片上特定区域检出，检出的数值导出到excel之后即可用于分析作图）

为了获得可靠的结果，各组之间应该控制相同的染色时间，拍照视野尽量选取相近的区域，分析结果时也应该设置相同的阈值，可以使用Image J的批处理功能快速计算结果。

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