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Elabscience生物素标记试剂盒怎么用?

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2023/12/27 9:21:48

Elabscience生物素标记试剂盒提供了标记所需的全部试剂,能简单有效地对含有伯氨基(-NH2)分子的蛋白标记。那么你知道Elabscience生物素标记试剂盒怎么用吗?让我们一起来看看吧!

一、实验物品

1. 高精度移液器及一次性吸头:0.5-10 μL、2-20 μL、20-200 μL、200-1000 μL

2. 37°C 恒温箱

3. 离心机(离心力可到 12000×g)

二、操作

1. 实验前准备

(1)试剂耗材准备:提前 20 min 从冰箱中取出试剂盒,平衡至室温(注:不需要用到的试剂组分继续放置在冰箱中)。

(2)超滤管浸润:向干燥的超滤管滤芯中加入 500 μL Labeling Buffer I,室温放置 10 min 备用,在加入待标记物之前弃去 Labeling Buffer I 即可(整个标记过程中超滤管滤芯都应该保持湿润)。

(3)溶解 NHS-Biotin:用 30 μL DMF 溶解 0.1 mg NHS-Biotin,静置 10 min,待其充分溶解,此时 NHS-Biotin 的浓度为 10 mM,盖好管子备用。

2.标记流程

图片1.png

3. 标记步骤(本操作步骤按照 1 mg 蛋白的量进行标记)

(1)浓缩换液:将 Filter device 正置于配套 Collection tube 里,取 1 mg 待标记蛋白加入 Filter device 中,并用 Labeling Buffer I 补充总体积到0.5 mL,盖好 Filter tube,以 12000×g 的转速离心 10 min,弃去Collection tube 中的液体。

注:

a) Filter device 的最大容积为 0.5 mL。

b) 如果1 mg蛋白体积大于0.5 mL,请分多次加入,离心超滤浓缩。

c) 如果待标记物中含有游离的氨基(Tris,氨基酸或者其他干扰物,需要用 Labeling Buffer I 反复超滤确保其去除干净)。

(2)回收定量:将Filter device倒置于配套Collection tube里,1000×g离心2 min,回收浓缩换液后的蛋白,取出 Filter device,向Collection tube 中加入适量 Labeling Buffer I至蛋白浓度约为2 mg/mL,同时在Filter device中加入0.5 mL Labeling Buffer I,置于管架上备用。

(3)标记反应:立即向蛋白溶液中加入 26.6 μL 的 10 mM NHS-Biotin,轻轻吹打混匀,盖上盖子密封,放入 37°C 恒温箱中避光温育 30 min。

(4)封闭终止:按比例每 100 μg 蛋白加入 10 μL 的 1 M Tris(pH 8.7),混匀后室温放置 10 min。

(5)超滤纯化:加入适量的1×PBS至上述反应液中,使终体积为0.5mL,轻轻吹打混匀,将反应溶液转移至甩干的 Filter device(若上述反应液已超过 0.5 mL,可超滤后分多次转移至甩干的 Filter device中),并与 Collection tube 配套后盖好 Filtration tube,12000× g的转速离心 10 min~30 min。后弃去 Collection tube 中液体,向Filter device中补足1×PBS至500 μL,重复离心超滤操作2~3 次。

(6)收集产物:加 0.2 mL 1×PBS至Filter device 中,轻轻吹打。将 Filter device 倒置于另一个 Collection tube中,1000×g 离心 2 min。收集Collection tube 中的溶液,即为生物素标记的蛋白。

3. 蛋白保存及使用

向标记后的蛋白中加入0.05~0.2% Proclin 300或0.05%die氮化钠,及蛋白稳定剂(如 0.1% BSA),于2~8°C 避光保存,可稳定保存半年。或加入等体积甘油于-20°C 存储,可稳定保存半年。

更多有关Elabscience生物素标记试剂盒的使用方法,请联系Elabscience试剂盒代理——北京百奥创新科技有限公司。



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