膜蛋白几乎在所有生理过程中都起着重要作用，这些作用包括但不限于细胞间接触、表面识别、酶活性或跨膜运输等。膜蛋白作为生物膜功能的主要承担者，其对于维持细胞乃至生物体的正常生理功能至关重要。据统计，约50%药物的靶向分子为膜蛋白，特别是跨膜蛋白，它们占据了已知药物靶点的很大比例。膜蛋白研究不仅有助于揭示疾病的发生机制，还能推动生物学研究的深入。此外，研究人员还可以设计出具有特定功能的膜蛋白或基于膜蛋白的生物材料。这些新材料在生物医学、环境保护、能源开发等领域具有广泛的应用前景。因此，膜蛋白的研究至关重要。
然而，目前膜蛋白研究依旧面临着困境。首先在生物体内膜蛋白的表达量较低，其次，因膜蛋白自身具有高度疏水性，因此它在溶液中很容易形成聚集体，另外膜蛋白可能包含多个跨膜区域，糖基化修饰等等，且它在常规条件下难以维持正确的构象。
一
研究背景
传统的基于细胞的膜蛋白表达通常会存在问题，比如：低产、细胞毒性、蛋白质聚集以及错误折叠等。而膜蛋白的结构和功能研究也因为难以生产足够数量的蛋白质产品而受到严重阻碍。随着生物技术的发展，无细胞蛋白质表达（CFPS）系统正被视为克服上述障碍的可行替代工具，因为在CFPS系统中几乎不需要考虑细胞活力和蛋白表达过程，此外，该系统的开放性允许研究人员直接控制反应条件，例如，添加辅助试剂，各种形式的脂质、催化剂等等。
图1:当前膜蛋白的CFPS策略
二
去垢剂存在下的CFPS
相比于传统的基于细胞的表达系统来说，CFPS系统由于其与细胞活性解耦的特性，提供了一种更加快速高效的蛋白质合成方案。而去垢剂在此过程中起到了关键作用，通过溶解膜蛋白并防止其聚集，从而去提高膜蛋白的可溶性和表达效率。
已有研究讨论了去垢剂对体外表达的膜蛋白的影响，那些在产量和溶解度方面都成功的实验是使用临界胶束浓度（CMC）相对较低的温和去垢剂，而为了防止聚集体或不均匀的蛋白质聚合物的形成，表达的蛋白质和胶束之间的摩尔比不得高于1。通常是不建议使用具有相对高CMC的去垢剂，因为它们必须以相当高的浓度存在，因此会抑制转录和翻译。
三
重组或直接插入囊泡和脂质体
体外膜蛋白重建的理想情况是在更类似于天然脂质双分子层的环境中工作。将膜蛋白重新构建或直接插入到囊泡和脂质体中，是CFPS系统中一种重要的策略，这有助于研究膜蛋白的功能和结构。其中重新构建策略有两种，包括从沉淀物中重新构建以及利用吸附剂颗粒。直接插入的策略也有两种，包括在无细胞表达反应中直接加入脂质体（如DOPC、DMPC等）以及利用倒转囊泡的方法。
通过重新构建或直接插入囊泡和脂质体的方法来实现更接近膜蛋白的天然环境，这将有助于保持膜蛋白的结构和功能，适用于功能研究和药物传递等。然而脂质体和囊泡的异质性可能会影响结构生物学研究，且高质量的倒转囊泡样本难以制备，商业上也不易获得。
四
使用纳米脂蛋白颗粒（NLPs）
为了克服使用微粒体和囊泡的局限性，最近提出了基于使用“纳米生物”或“纳米脂蛋白颗粒”（NLP）的新策略。它是一种纳米级的盘状颗粒，由两亲性螺旋蛋白（即支架蛋白）包裹在脂质双分子层的平面圆周上形成。NLPs的直径取决于所使用的支架蛋白类型，通常在9～20纳米之间，且分子质量偏差非常小（<5%），这使得它们具有高度的单分散性。这种结构为膜蛋白的表达和研究提供了理想的平台。
NLPs通过其的结构，能够稳定地包裹和呈现膜蛋白，有助于保持其天然构象和功能。与微粒体和囊泡等传统载体相比，NLPs具有更高的稳定性和可控性，从而显著提高了膜蛋白的表达效率和纯度。此外，NLPs还具有高度的可定制性，可以通过选择不同的支架蛋白（如载脂蛋白A1、E和C，以及昆虫的脂磷蛋白等）来适应不同类型的膜蛋白需求。
图2:NLP存在下的无细胞蛋白质表达
五
未来展望
1. 结构生物学领域的挑战与机遇
尽管CFPS技术在研究膜蛋白方面已经取得了显著进展，部分膜蛋白结构已通过X射线晶体学和固态核磁共振（NMR）技术得到解析，但在结构生物学领域仍面临重大挑战。未来，需要更多地探索CFPS技术与结晶技术（如脂质立方相结晶）之间的协同效应，比如使用NLP（纳米脂质颗粒）-蛋白质复合物而非去垢剂溶解的蛋白质来填充立方相基质，以期提高结构解析的成功率和质量。
2.多样化表达策略
CFPS膜蛋白在产量、溶解度和蛋白质质量方面取得了显著改进。未来，这一领域的研究将继续聚焦于优化反应条件，以较大化膜蛋白的产量，并改善其溶解性和功能活性，从而推动下游应用的发展。无细胞表达膜蛋白的策略多种多样，包括在去垢剂存在下的表达、作为沉淀表达、在脂质体或囊泡存在下的表达、使用NLPs的表达，以及与支架蛋白的共表达等等。每种策略都有其优势和局限性。未来的研究将进一步开发和优化这些策略，以适应不同类型的膜蛋白和研究需求。
3.跨学科合作与技术创新
膜蛋白研究的复杂性要求跨学科的合作，包括生物化学、分子生物学、物理学和材料科学等领域。未来的研究将借助高通量筛选、机器学习等新技术，加速新方法的开发和应用，以提高无细胞表达膜蛋白的效率和成功率。
随着无细胞表达膜蛋白技术的不断成熟，其应用前景也将更加广阔。在药物研发、生物传感器、生物能源、环境修复等领域，膜蛋白都展现出巨大的潜力。未来，将更多地探索这些潜在应用，推动相关技术的转化和商业化。
参考文献：
Manzer ZA, Selivanovitch E, Ostwalt AR, Daniel S. Membrane protein synthesis: no cells required. Trends Biochem Sci. 2023;48(7):642-654. doi:10.1016/j.tibs.2023.03.006
