骨形态发生蛋白的基础研究及临床应用

自1965年zui早利用脱钙骨基质在肌肉内诱发异位成骨后，人们在纯化脱钙骨移植物活性成分的过程中发现了骨形态发生蛋白（bone morphogenetic protein,BMP）家族。此后，随着基因工程技术的广泛应用，骨诱导和BMP的研究日趋活跃，对其理化和生物学特性做了更深入的研究，BMP已证明是正常胚胎时期骨、牙组织内部骨和成年骨修复中zui重要的诱导分化因子。这组蛋白质的发现，无论对基础生物学研究，还是对于临床应用都具有重要的价值。
　　
　　1 BMP的性质
　　
　　随着重组DNA技术的应用，目前已鉴定并克隆出16种BMP，除了BMP-1（一种由730个氨基酸组成的富含半胱氨酸的前胶原C蛋白酶）外，均属于转化生长因子β（transforming growth factor,TGF-β）超基因家族中的成员[1]。BMP在细胞内以前体形式合成，前体由一个信号蛋白和一个由100～125个氨基酸组成的羧基末端（C-末端）组成。大部分的BMP的C-末端含有7个高度保守的半胱氨酸残基，其中6个半胱氨酸残基在多肽链内部形成二硫键，1个半胱氨酸残基参与肽键间二硫键的形成，使2个多肽键相互连接成二聚体，这种典型的局部二硫键结构称为半胱氨酸结。所以成熟的BMP蛋白结构是由二硫键连接的同型或异型二聚体。这种二聚体释放到细胞外，与机体各处靶细胞表面的相应受体结合而发挥作用。
　　
　　2 BMP受体及其活化途径
　　
　　目前已知BMP受体（BMPR）有两型：BMPRⅠ（BMPRⅠA和BMPRⅠB）及BMPRⅡ，它们分别起丝氨酸和苏氨酸激酶的作用，在结构和功能上和TGF-β、激动蛋白受体非常相似。BMPRⅠA及BMPRⅠB结构相似[2，3]，它们的胞外段都很短，近膜侧有保守的“Cys盒”，胞内有STK活性区域。BMPRⅡ较BMPRⅠ大，胞内羧基端有富含苏氨酸和丝氨酸的尾巴；BMPRⅠ胞内区的近膜部分（N末端）有高度保守的丝氨酸、甘氨酸（GS）结构域，是活化起始的部位[4]。
　　BMPRⅡ可以自身磷酸化，同时还可以磷酸化上游的BMPRⅠA及BMPRⅠB。BMPRⅠA、BMPRⅠB及BMPRⅡ各自与BMP的亲和力很弱，不能单独介导信号传递。BMP与BMPRⅡ结合时，BMPRⅡ使BMPRⅠ上GS域磷酸化，然后BMPRⅠ（BMPRⅠA和BMPRⅠB）与两分子BMPRⅡ形成具备BMP高亲和力的异四聚体，为丝氨酸和（或）酪氨酸激酶受体。在信号转导中BMPRⅠA起主要作用，BMP信号的特异性主要是由BMPRⅠA决定的。BMPRⅠ将Smad1、5可能还有8的MH2结构域磷酸化，Smad1或5（8）与Smad4结合成二聚体进入核内，对核内活动进行调控。一旦Smad1或Smad5被激活，就可以使成肌细胞转化为成骨细胞，此时不再需要BMP的存在。目前认为Smad8在结构上类似Smad5与Smad1，但还未见有对其功能的报道[5]。
　　Smad6通过与BMPRⅠ结合，或者结合Smad1（与Smad4竞争）生成无活性复合体两种方式逆调节信号传导。此外，还有一系列Smad相互作用蛋白（SIP）与Smad1、4二聚体结合来调控其作用[6]。
　　Smads是MAD（mothers against dpp）的同系物（MAD是果蝇基因图谱中的一种基因编码的50～60 KD蛋白质，这种蛋白质是细胞对dpp蛋白产生反应所必须的，可以补救dpp缺失突变的分子；MAD同系物在线虫、果蝇、蟾蜍和人中都有发现，统一命名为Smads），MAD蛋白对TGF-β超家族的细胞内信号传递起着非常重要的作用。目前认为Smad家族有8个成员，拥有保守的N末端（MH1）及C末端（MH2），中间被非保守的苏氨酸、丝氨酸、脯氨酸连接区隔开。不同的TGF-β超家族成员通过不同的Smad传递信号。Smad2及Smad3介导TGF-β和Activin信号，而对BMP2则无反应。但TGF-β、Activin都不能诱导Smad1磷酸化。Smad4表现为其它Smads的伙伴。
　　磷酸化的Smad可以激活成骨细胞特异因子2（OSF2）基因，产物OSF2蛋白具有激活转录的功能，其分子结构在果蝇和人之间具有较大的相似性。OSF2蛋白及其同系物之间有保守的runt区，含有Val-Trp-Arg-Pro-Tyr（VWRPY）基元及一个由128个氨基酸组成的亚单位。OSF2蛋白通过runt区聚合成异二聚体。然后可以与成骨细胞特异性基团2（OSE2）特异性结合，激活骨钙素转录启动子。骨钙素是成骨细胞的分子标记物，细胞一过性转染OSF2的cDNA也可诱发骨钙素、骨涎蛋白和骨桥蛋白的表达。目前认为，OSF2可能是触发间充质干细胞向成骨细胞转化的因素。OSF2缺乏的鼠可造成骨细胞的缺乏，OSF2杂合性鼠则表现为骨骼发育畸形，类似于人颅骨、锁骨发育异常。
　　
　　3 BMP的生物学功能及作用机制
　　
　　3.1 BMP在胚胎发生过程中的作用：借助靶基因技术，人们对BMP在骨骼形成和修复过程中的作用进行了卓有成效的分析。迄今为止的研究表明，BMP在胚胎发生的3个不同阶段发挥作用：（1）在胚胎发生早期，BMP的作用是指导机体轮廓的形成及确定组织类型和轴心；（2）在随后的器官发生阶段，各种特定功能BMP在机体不同部位诱导各种骨骼结构和支撑连接组织的形成；（3）在成熟动物体内，BMP影响骨骼骨折后成功修复的能力[7]。
　　3.2 BMP与骨诱导：在正常骨形成与修复过程中需要3个基本条件即诱导因子、靶细胞及适宜的环境[8，9]。在对BMP的生物活性分析中发现，BMP的诱导成骨作用大致可分为3个时期：趋化期、有丝分裂期、分化期。首先是间充质细胞发生化学趋化、聚集、分化形成软骨和骨，zui后形成骨髓。故认为BMP的靶细胞是一类未分化的、在一定刺激下有成骨潜能的间充质细胞。已有实验证明，无论是胚胎期还是成年期，骨组织细胞均来源于一种未分化的间充质细胞，并且成骨细胞、软骨细胞、肌细胞、脂肪细胞和成纤维细胞均是由未分化的间充质细胞衍生而来的。间充质细胞在分化过程中受多种调节因子的控制，定向分化为具有各种表型的细胞。如果不受BMP等因子的作用，它在整个生命中都不会分化形成软骨和骨 。成骨细胞的分化过程至少可分为两个阶段：*阶段是由未分化的间充质细胞定向分化为成骨细胞的前体细胞，第二阶段是由前体细胞转化为成熟的成骨细胞。BMP的主要生物学作用就是诱导间充质细胞分化为成骨细胞，进而产生新生骨。BMP诱导成骨的方式主要是软骨内化骨，但也可以膜内化骨方式成骨。Caraliis和Kubler发现单独将成年家兔的骨外膜植入异位组织，并无骨形成，但当BMP共同植入时则出现骨组织。Horisaka将BMP与羟基磷灰石载体结合后植入大鼠顶骨的骨外膜下，7天后即有软骨和骨形成。这说明骨外膜的某些细胞受BMP刺激后可以膜内化骨方式成骨。BMP还可刺激培养的骨膜细胞成骨细胞表型。
　　3.3 BMP的作用机制：BMP是多效性调节因子，可对细胞趋化、分裂、分化、细胞外基质合成、维持细胞表型及凋亡等诸多方面发挥作用，控制着骨诱导瀑布反应的几个关键步骤。BMP具体起什么作用视依赖于其浓度的阈值剂量而定：BMP-3和重组BMP-4在小剂量（f mol范围）对人单核细胞有趋化作用，刺激有丝分裂的剂量为100 pmol/L，启动分化的zui适剂量为1～10 mmol/L。BMP在诱导软骨成骨时，在骨形成的前先有软骨形成，因此各种BMP都是软骨生成蛋白（chondrogenic protein）。肢芽中胚层细胞的软骨形成就是由BMP-4启动的。关节软骨也呈现BMP样活性，现已分离出几种活性蛋白，并分别命名为软骨衍生形态蛋白1、2、3（CDMP1、2、3或GDF5、6、7）。