什么是树突状细胞（DC）？
DC细胞是“Dendritic Cell”，中文名称是树突状细胞。树突状细胞是人体内有效的抗原递呈细胞（antigen presenting cell, APC）。DC细胞是能够显著刺激初始T细胞增值的APC，其他种类的APC（如单核巨噬细胞，B细胞等）仅能刺激已活化的或者记忆性的T细胞，因此DC细胞是适应性T细胞免疫应答的始动者，在肿瘤免疫中发挥着及其重要的作用。DC 表面高表达MHC -I和MHC -II类分子，具有特异性表面标志的细胞。其对抗原摄取，加工以及刺激T细胞使其激活，并最终决定T细胞的分化方向。
DC的来源
DC细胞在体内含量甚微, 从体内直接分离出DC耗时而且细胞产量很低，这极大地限制了DC的研究和应用。但DC能从不同组织里的DC前体细胞分化、诱导而来, 如骨髓液的前体细胞，外周血和脐带血的单核细胞。
对于人，由于人外周血的取材最为方便且单核细胞数量最多，所以常用的方法是从人外周血单个核细胞(PBMC)诱导DC。而对于小鼠，最常见的方法是从骨髓细胞诱导产生DC，即骨髓来源的DC(Bone Marrow-Derived Dendritic Cells，BMDC)。
图1.经典的 BMDC 制备方法简图
BMDC制备方法
常见的小鼠BMDC制备方法有：
BMDC的大量制备法—Lutz法。
经典的BMDC培养法-Inaba法（改良）
背景
1. Inaba法获得的BMDC 数目为5-7 x 106个/小鼠；
2. Inaba原法仅用GM-CSF来诱导BMDC的产生，虽然得到的BMDC在混合淋巴细胞反应中有较强的刺激能力，但DC的成熟度不及GM-CSF+IL-4的联合诱导，所以后来的改良法中多用GM-CSF+IL-4联合诱导。
培养步骤
1. 小鼠骨髓细胞的获得
1.1 小鼠(6-10周龄)颈椎脱臼法处死，手术取出所有股骨和胫骨，并剪刀和镊子将骨周围的肌肉组织尽量去除干净；【注】：不要损伤到骨。
1.2 将骨移至超净台内，并用盛有70%酒精的无菌培养皿浸泡2-5min，以消毒灭菌，然后用无菌的PBS洗2次；
1.3 将骨移入另一个盛有PBS 的新培养皿中，用剪刀剪去骨两端，再用注射器抽取PBS，针头分别从骨两端插入骨髓腔，反复冲洗出骨髓至培养皿中，直至骨变白；
1.4 收集骨髓悬液，用200目尼龙网滤去小碎片和肌肉组织；
1.5 过滤液1200rpm 离心5min，弃上清；
1.6 加入2 ml氯化铵红细胞裂解液(1x)，重悬细胞，室温孵育3-5min，最长10min；
1.7 加入10 ml PBS 中和裂解液的作用，然后1200 rpm 离心5min，弃上清;
1.8 PBS 洗1 次，然后用含10% FBS的RPMI1640培养液重悬细胞，至此已获得小鼠骨髓细胞。
氯化铵红细胞裂解液的配制：
1）先配制10x的贮存液，配法如下：称取82.9g NH4Cl，10.0gKHCO3和0.37g Na2EDTA，溶于1L的蒸馏水中，0.22μm滤膜过滤除菌，4℃储存6个月；
2）临用前，将10x贮存液用无菌蒸馏水1 : 9稀释成1x工作液即可。
【注】：因氯化铵红细胞裂解液对骨髓细胞有一定的伤害作用，所以要尽量缩短溶血时间。
2. BMDC 的诱导分化
2.1 步骤1中获得的小鼠骨髓细胞计数后用含10% FBS的RPMI 1640培养液调整细胞浓度为0.5-1x 106/ml；
2.2 铺至24 孔培养板内，每孔1ml 细胞，同时加入重组小鼠GM-CSF (20ng/ml)和IL-4 (10ng/ml)，37℃，5% CO2培养箱培养，此为培养的第0天；
【注】：
1) 一般一只小鼠大约可收获4-5x107个骨髓细胞，所以可以铺至少40-50个24 孔板板孔。
2)GM-CSF 和IL-4 的使用浓度区间分别为20-50ng/ml 和10-40ng/ml。
2.3 每2天轻轻摇晃培养板，然后3/4 体积更换新鲜培养液，并补足细胞因子。
2.4 在第5天和第8天之间，轻柔吹打培养液，收集悬浮细胞及疏松贴壁生长的细胞；
2.5 1200rpm离心5min，弃上清；
2.6 用含10% FBS的RPMI 1640培养液重悬细胞并计数，然后调整细胞浓度至1×106/ml，并加入重组小鼠GM-CSF (20 ng/ml)和IL-4 (10ng/ml)；
2.7 细胞铺板至100mm培养皿(每皿最多10ml)或6孔培养板(2m/孔)。
2.8 37℃，5% CO2培养箱继续培养1-2天；
2.9 收集悬浮细胞，即为较成熟的BMDC。
【注】：
1）第2.5-2.8步为再铺板步骤，目的是使第2.4步获得的BMDC更加成熟。
2）再铺板后的3h内可见许多棘状贴壁细胞从DC簇中迁移出来，而培养1天后会发现这些贴壁细胞从培养板底脱离，而且可以看见在培养液中漂浮着许多典型的DC。
3. BMDC的成熟
【注】：
步骤2中获得的BMDC并非成熟的DC，若想得到成熟的DC，还需LPS，CD40L 或TNF-a 等的诱导。
3.1 步骤2.4 或2.9 中获得的BMDC以1200rpm离心5min，弃上清；
3.2 用含重组小鼠GM-CSF (20 ng/ml)和IL-4 (10ng/ml)的RPMI培养液重悬沉淀，计数后调整细胞浓度为1×106/ml；
3.3 加入24 孔培养板中，并加入成熟诱导剂，如TNF-α (250U/ml)，LPS (1μg/ml)、或CD40L(1μg/ml)等；
3.4 37℃，5% CO2 培养箱培养2天；
3.5 收集悬浮细胞及疏松贴壁生长的细胞即为成熟树突状细胞。
背景
1. 该法可在7天内获得30-40×106个DC/小鼠，是Inaba 经典方法的7-10 倍。DC经14.5%甲泛葡胺(Metrizamide)梯度离心后，纯度(即CD11c+/I-Ab+细胞)可达85-95%。
2. 该法获得的DC 的内吞能力弱于Inaba 经典方法，但分泌的IL-12p70 量相似；
3. 该法获得的DC 在混合淋巴细胞反应中比Inaba 经典方法呈现更强的刺激能力；
4. 该法获得的DC 能引起更强的特异性T 细胞反应；
5. 综上，Son法比经典方法能获得更多、更成熟的BMDC。
培养步骤
1. 小鼠骨髓细胞的获得
见Inaba 法(改良)中的相应步骤。
2. BMDC 的大量制备
2.1 步骤1 中获得的小鼠骨髓细胞计数后用含10% FBS 的RPMI 1640 培养液调整细胞浓度为2× 105 /ml；
2.2 铺至6 孔培养板内，每孔5ml 细胞，同时加入重组小鼠GM-CSF (1000U/ml)和IL-4 (1000U/ml)，37℃，5% CO2 培养箱培养；
2.3 在培养的第4天，向培养体系中补充重组小鼠GM-CSF (1000U/ml)和IL-4(1000U/ml)；
2.4 培养的第7天收集DC，用2-4ml RPMI 1640培养液重悬，加至等体积的14.5%(w/v) 甲泛葡胺上，1200xg 室温离心20min；
【注】
此时的DC 为不成熟的BMDC，要想进一步成熟，请跳至步骤3。
2.5 收集中间层，并用RPMI 1640培养液洗3次备用。
3. BMDC 的成熟
3.1 步骤 2.4 中收集的BMDC，重新铺板，并向培养体系中加入重组小鼠GM-CSF(1000U/ml)和IL-4 (1000U/ml)，以及LPS (1-10μg/ml)
3.2 37℃，5% CO2 培养箱培养2天，获得成熟的BMDC。
BMDC大量制备法-Lutz 法
背景
1. Lutz法与Son法相似，均可大量制备BMDC，但与Son法相比，Lutz 法更为广泛地被采用。
2. 该法可获得更多的BMDC，达1-3 x 108个DC/小鼠，而且纯度可达90-95%；
3. 该法比Son 法使用的细胞因子浓度低得多，仅为200U/ml，而且培养的第8天到第10天降为30-100U/ml，这样可以大幅节约试剂成本；
4. 该法与Inaba 经典方法和Son法的最大不同是使用细菌培养皿(Petri dish)而非细胞培养板来培养骨髓细胞。Inaba的解释是细菌培养皿不容易使骨髓中的巨噬细胞贴壁，从而抑制巨噬细胞的发育，进而避免巨噬细胞对DC 成熟的抑制作用，这可能是该法能够以较低铺板密度获得大量BMDC的主要原因。
5. 但该法的培养时间较长，需要10-12天，一方面是为了获得更多的BMDC，另一方面，大多数粒细胞和淋巴细胞很难存活这么长时间，因此可提高最终获得的BMDC 的纯度；
6. 该法仅用GM-CSF 进行诱导培养，得到的BMDC中未成熟和成熟DC均有，若要进一步提高成熟度，需用LPS或TNF-α再诱导1-2天，其中成熟DC细胞的含量将达到50-70%。
培养步骤
1. 小鼠骨髓细胞的获得
见Inaba 法(改良)中的相应步骤，注意省去溶血步骤。
2. BMDC 的大量制备
2.1 步骤1中获得的小鼠骨髓细胞计数后用含10% FBS 的RPMI 1640培养液调整细胞浓度为2×105/ml；
2.2 铺至100mm 细菌培养皿(Petri Dish)中，每皿10ml 细胞，同时加入重组小鼠GM-CSF (200U/ml)，37℃， 5% CO2 培养箱培养；
【注】：
此处使用的是细菌培养皿，而非细胞培养板。
2.3 第3天时，向培养皿中再加入10ml 含20ng/ml 重组小鼠GM-CSF 的培养液；
2.4 第6天和第8 天分别半量换液，即收集旧培养液，离心后用含20ng/ml 重组小鼠GM-CSF 的培养液重悬细胞沉淀，然后再将细胞悬液放回原皿；
2.5 第10天时可收集细胞，即为BMDC。
3. BMDC 的成熟
3.1 培养第10天的DC用移液器轻轻吹打收集悬浮细胞，300xg 室温离心5min；
3.2 弃上清，用10ml RPMI 1640 培养液重悬细胞沉淀，然后铺于100 mm 细胞培养板；
3.3 加入重组小鼠GM-CSF(100U/ml )和TNF-α(500U/ml)，或重组小鼠GM-CSF(100U/ml)和LPS (1μg/ml)；
3.4 37℃，5% CO2培养箱继续培养1-2天。
BMDC的鉴定
1. 形态学观察：BMDC多数呈集落生长，细胞有多个树突样突起，成熟的BMDC 更加明显；
2. 细胞表型分析：流式细胞术检测DC 细胞表面CD11c，CD40，CD80，CD86，MHCII 类分子(I-A/I-E)等的表达，BMDC高表达这些分子，成熟的BMDC中这些分子的表达会进一步提高。
3. 混合淋巴细胞反应(MLR)：BMDC具有较强的刺激能力，且成熟度越高，刺激能力越强。
成熟诱导剂该如何选择？
LPS，CD40L 和TNF-α无论对人DC 还是小鼠DC 均是常用、有效的成熟诱导剂。TNF-a 诱导DC 的成熟能力在三者中最弱。LPS 和CD40L 均是DC 体外成熟的强诱导剂，两者诱导DC 的成熟度相似，但诱导产生的细胞因子谱有差异。CD40L诱导成熟的BMDC 在体内显示出的免疫调节能力，包括保护性和治疗性肿瘤免疫反应的产生。用LPS刺激DC成熟所用的浓度一般为1-10μg/ml，但其实0.1 μg/ml 已经有非常强的作用，但保险起见，一般选用1μg/ml。对于CD40L 需要注意的是，CD40L 分子属于TNF 配体家族，该家族的特点是在形成三聚体后才能发挥作用。所以最好能用重组的CD40L三聚体蛋白来刺激DC，这样会有很好的效果。如果用CD40L 单体来刺激DC，多数情况下成熟度并不是很高。
培养方法的选择
表1.BMDC制备3种实验方法对比
参数 | Inaba法 | Son法 | Lutz法 |
在PubMed被引用次数 | 783 | 24 | 663 |
骨髓溶血裂解红细胞 | 是 | 是 | 否 |
骨髓先去除淋巴细胞 | 是 | 否 | 否 |
培养过程中去除粒细胞 | 是 | 否 | 否 |
骨髓细胞最初铺板体积 | 1ml | 15ml | 10ml |
培养器 | 24孔细胞培养板 | 6孔细胞培养板 | 100mm细菌培养皿 |
培养液 | RPMI 1640+10% FCS | ||
小鼠GM-CSF浓度 | 200-1000U/mL | 开始为125-1000U/mL 第4天和第7天，向培养体系中再添加足量的GM-CSF和IL-4。 | 开始为200U/mL 第10天后3-100U/mL |
小鼠IL-4 | 不用 | 用，浓度同GM-CSF | 不用 |
换液方法 | 第2天和第4天吸弃50%-75%的旧培养液（其中含有细胞），然后换含足量GM-CSF的新鲜培养液 | / | 第3天补充等体积含GM-CSF的培养液，第6,8和10天半量换液，吸出的旧培养液（其中含细胞）离心后用含GM-CSF的新鲜培养液重悬后放回。 |
传代前培养时间（扩增） | 6天 | 7天 | 10天 |
传代后培养时间（成熟） | 2天 | 无 | 1-2天 |
成熟诱导剂 | TNF-ɑ（250U/mL） | LPS(1-10μg/mL) | TNF-ɑ（250U/mL）或LPS(1μg/mL) |
DC收获时间 | 7-8天 | 7-8天 | 10-13天 |
DC纯度 | 第8天：60-70% | 第7天：85-95% | 第10-12天：80-90% |
DC产量/小鼠 | (5-7)×106 | (3-4)×107 | (1-3)×108 |
DC培养试剂推荐
产品名称 | 货号 | 规格 |
Mouse GM-CSF | 91108ES | 5μg/50μg/100μg/500μg |
Mouse IL-4 | 90144ES | 5μg/50μg/100μg/500μg |
Mouse TNF-α | 90621ES | 5μg/20μg/50μg/500μg |
Mouse CD40L Trimer Protein | 94016ES | 25μg/100μg/500μg |
