估计 EV的 数量、确定 EV 的存在以及评估EV 制备中非 EV 组分的份额和影响等都需要对EV进行表征。EV的表征面临着小粒径、尺寸异质性和分子异质性、缺乏通用 EV 识别方法以及许多测量技术的非 EV 特异性的挑战。没有任何一种测量或方法能够满足所有 EV 表征的要求，因此建议使用正交方法（即没有相同测量限制的方法）彼此验证，也就是说EV的表征参数作为关键质量属性 (CQA) 推荐采用两种或两种以上不同原理的方法检测同一指标。
EV 的总体组成（蛋白质、脂质、核酸和其他生物分子等的含量及比例）因 EV 来源而异。虽然这些单个分子类别的测量可用于估计 EV 丰度，但这些值不一定与 EV 浓度全部相关，而且源材料之间也不存在普遍性；因此，它们不应用作 EV 浓度的衡量标准。正如没有单一分子的检测可以量化所有 EV 一样，也没有 EV 或 EV 亚型的通用分子标记。必须根据来源特异性和类型特异性的证据来选择特定的标记。目前，尚无已知的通用标记可以识别所有EV，无论其来源如何。对于所谓的外泌体，这些标记的普遍性尚不清楚或不被接受。请注意，涉及四次跨膜蛋白 CD9、CD63 和 CD81 的基于亲和力的方案对于作为 EV 亚型的外泌体并不具有特异性；使用针对这些四次跨膜蛋白中的某一个的抗体富集的EV群体并不能不全面覆盖所有的分子组成。此外，并非所有 EVs都表达这些蛋白标志物，因此四次跨膜蛋白富集并不能捕获所有 EVs。检测同一表征参数的正交方法（不止一种原理的方法）不太可能具有相同的偏差；例如，同时通过光学方法与非光学方法分别推导和检测EV的直径。使用正交方法对 EV 样本进行表征，对于证明共分离物与生物标志物或功能发现无关也至关重要。由于许多EV表征方法不是特定适用于EV的，或者无法检测所有的EV，因此需要将方法和结果透明公布以确保EV数据的可重复性。
EV 的数量和体积测量一同定义了数浓度（以particles/mL 为单位），这是一种被广泛报道并使用的指标。然而，它通常不可靠，因为许多技术缺乏对EV的特异性和对所有EV的敏感性。ISEV 严格和标准化EV参考材料工作组最近概述了测量技术的考虑因素，以及该领域在面对可追溯测量、开发和报告良好表征的EV参考材料方面所面临的挑战。这项工作的一个关键亮点是需要公布检测方法的 LOD，从而允许其他人验证结果，而不管灵敏度限制如何。通过使用正交方法可以提高 EV 浓度测量的可信度，每种方法都具有确定的 LOD，例如检测光散射强度（如NTA）、荧光强度（如FCM）和物理大小（如RPS），因为正交方法没有相同的测量限制。例如，电阻脉冲感应 (RPS) 技术，就可以用粒径来表示 LOD。对于流式细胞术等光学技术，LOD 可以用源自光散射光学模型的直径或源自荧光强度的等效可溶性荧光团 (MESF) 分子来报告。这些方法可以在不同仪器和灵敏度之间产生一致的数据。由于颗粒检测涉及的变量较多，因此目前尚无方法为纳米颗粒跟踪分析 (NTA)、动态光散射 (DLS) 或成像流式细胞术得出可追溯的 LOD。对于无法区分 EV 与其他潜在共分离物或污染物的技术，无论上游分离步骤如何，都建议将浓度报告表示为“颗粒浓度或 EP 浓度”而不是“EV 浓度”。EV 大小（以纳米半径或直径为单位）的测量依赖于球形度或迁移率等假设，并且输出结果可能受到上游变量的影响。常见的高通量方法，包括流式细胞术、NTA、RPS、多角度光散射和动态光散射 (DLS) 都假设 EV 是球形的。虽然“大小”和“直径”经常在测量方法之间互通使用，但它们的推导方式也可能导致测量技术间的一致差异。例如，依赖于颗粒布朗运动的技术（如 NTA 或 DLS）测量的是流体动力学直径，与冷冻电镜等成像方法相比，会导致颗粒大小估计过高。而很少有方法能够在整个EV可能的直径范围内（从几十纳米到微米）精确测量 EV 尺寸。例如，虽然冷冻电镜的高分辨率成像是最准确的方法之一，但它的检测通量相对较低，而且许多较大的 EV 往往数量较少而可能无法量化。定量低于 100 nm 的低对比度 EV 的能力也可能是一个限制因素。
随着越来越多的研究人员使用灵敏度更高的专用单颗粒分析技术，越来越清楚的是，许多 EV 制剂表现出不对称的右偏分布，例如对数正态分布，其中大多数 EV 直径 <100 nm。大多数单颗粒分析技术无法解析全部的 EV 群体，因此研究者应共享检测到的 EV 直径分布，而不仅仅是平均大小、集中大小或中位值大小等汇总指标，这些指标很容易由于 LOD 和不对称大小分布而倾斜。请注意，拟合大小统计数据，例如通过 NTA 对低折射率颗粒进行测量，可能更接近仪器的 LOD而不是 EV 群体的真实模态直径。使用具有专有算法的软件来确定粒径的技术也可能导致软件版本或软件平台之间的差异，因此也应该提供软件及其版本。从折射率假设推导出大小的技术可能会由于不同的样本成分和装载物而导致变化。从荧光探针（例如膜嵌入染料）推导的大小则可能会由于基于不同膜脂成分的不同染料嵌入而导致变化。对于无法区分 EV 和共分离物/污染物的技术，无论上游分离步骤如何，建议将直径报告表述为“颗粒”或“EP”直径，而不是“EV 直径”。
随着 EV 检测实验和仪器的使用和专家知识的拓展，相关表征报告尺度的确定也在不断增加，以确保数据的可靠性和可重复性。MISEV2023指南详细列出了最小实验和仪器特定报告的注意事项列表。无论实验设计如何，这些通常都适用。这里列出的技术并不详尽，许多检测技术正在开发或正在积极研究。然而，所列出的技术都是商业上可获得的，并且有来自多个研究人员的发表文献。（由于篇幅限制，笔者在此只列出当前常用的几种EV粒径和浓度表征工具的描述及其主要观点）ISEV建议，对照组应包括作为检测抗体的同型抗体，或同型偶联的捕获微珠，以及仅含有检测抗体的捕获微珠（用于抗体包被的捕获珠）；应使用多个 EV上样浓度来展示信号的滴定；如果制备微珠，应公布其试剂和化学成分；商业捕获微珠试剂的目录和批号也应公布；公布标准化微珠的中位荧光强度值；公布来自单态圈定微珠的等效可溶性荧光团 (MESF) 分子的数据和中位荧光强度值统计（与单 EV 流式细胞术一样）；应公布完整且详细的方法学。2023年，经由国际细胞外囊泡学会（ISEV）、国际细胞计数进步学会、国际血栓与止血学会组成的三学会工作组（EV流式细胞术工作组）倡议，出版了《单EV流式细胞术纲要》，全面解决开发单 EV 流式细胞术检测的注意事项。样本体积、荧光和光散射参数的校准对于单 EV 流式结果的解释和复制至关重要。如果使用单 EV 流式细胞仪报告颗粒浓度，请确定LOD的上限和下限，以允许使用正交方法或其他人来重复和验证该结果。目前，成像细胞仪使用动态触发方法，这使得较低 LOD 的确定难以定义，因此难以标准化。DLS，也称为光子相关光谱 (PCS) 和准弹性光散射 (QELS)，是一种能够确定稀释水溶液分散体中充分单分散颗粒的流体动力学直径的技术。DLS 测量溶液中多个颗粒散射的激光强度的自相关函数。自相关函数携带有关颗粒扩散系数的信息，该信息通过斯托克斯-爱因斯坦布朗运动理论与流体动力学直径相关。可以使用多种算法从测量的自相关函数导出扩散系数。最常见的方法是累积量分析，但是它假设样本都是单分散的大小分布，而 EV 样本是不具备这种分布的。对于 EV 样本的多分散大小分布，扩散的推导自相关函数的系数分布成为一个不适定的数学问题。这意味着 DLS 不应用于确定 EV 样品的定量属性，除非 DLS 应用于 EV 的具有单分散尺寸的某一部分。另一方面，DLS 可用于定性确认 EV 样品中可能存在的亚微米颗粒和可能的聚集体的存在。各种电子显微镜 (EM) 是少数能够检测EV（无论大小如何）的技术之一。然而，电镜的通量也意味着与较小的EVs相比，较大的EVs在统计上会被低估。SEM、TEM和Cryo-EM都是高分辨率的EV表征方法，它们也不必互相切换或能够提供具有质量可比的图像。例如，Cryo-EM可以清楚地显示脂质双层结构，比TEM用于固定样品的脱水条件更好地保持了 EV 形态，并且可能更加准确定量（大小），因为一定体积中的所有颗粒都可以成像，而不仅仅是那些粘附在载网表面上的颗粒。为确定低报告要求而对 EM 方法进行的标准化研究非常有限。对于 TEM，应公布三个主要参数：固定、吸附和负染色方法。固定包括：使用的固定剂及其浓度和孵育时间；吸附包括载网材料、载网尺寸、薄膜类型、涂层、孵育时间和清洗细节；负染色的详细信息应包括底物、浓度和孵育时间。并且，应公布低倍率和高倍率图像以及图像的选择标准。NTA，也认为是一种单颗粒跟踪，是 EV 领域广泛使用的一种光学技术，用于估计颗粒尺寸和浓度。NTA 通常采用减少直径分布变化的算法，通过测量颗粒的扩散系数得出流体动力学直径。值得注意的是，某些NTA设备上使用的 FTLA 算法是为了更好地表示单分散混合物而开发的，而 EV 则不然，这可能会导致人为的多种拟合分布。并且，目前没有方法可以确定或公布 NTA 设置 的LOD。很多学者已经进行了几项标准化研究来比较用户和仪器之间的结果。使用 NTA 测量复杂生物流体样本的直径分布和浓度应谨慎解释，因为它会对脂蛋白和大蛋白复合物等共分离物进行计数，并且NTA难以量化直径在几百纳米以上的 EV。对于 NTA 的公布信息，应包括仪器型号、相机类型、相机设置、激光波长、激光功率、软件版本、分析设置和每帧粒子。如果已知，则应公布用于生成直径分布的算法，因为根据所使用的算法可能会产生不同的结果。在光散射或荧光检测模式的情况下，建议使用空白缓冲液作为对照。对于荧光 NTA，报告光散射模式下的总颗粒数以及荧光模式下的标记颗粒数，以及标记去除方法和缓冲液/试剂控制从而评估标记的伪彩情况。如果使用了流体上样装置也应将其设置公布。这是MISEV第一次将电阻脉冲感应 (RPS) 技术作为与基于流式的方法（包括基于微珠的流式和单EV流式）和基于显微镜的方法（包括原子力显微镜、电镜、DLS、NTA、超分辨显微镜等）并列推荐的常用EV颗粒表征方法。也是为数不多的非光学原理的EV表征技术之一。RPS利用库尔特原理来确定颗粒的浓度和直径，以及某些设备还具备zeta 电位功能。目前 RPS 的直径LOD低至 ∼50 nm。文献报道，RPS 测量结果确实与 TEM 数据具有非常高的一致性。报告 RPS 数据时，建议公布仪器型号、孔径、校准微珠直径和来源以及软件版本。如之前所述（颗粒大小的定量），对于 EV 数据，推荐公布RPS的直径分布而不是单一直径统计数据。并且建议纳入空白缓冲液的对照来识别背景，以及相同浓度的去污剂裂解后的样品以确定标记事件。由于 RPS 技术很容易被较大颗粒堵塞，因此可以使用离心或过滤等分析前步骤来去除较大颗粒。由于这些方法可能会改变正在分析的 EV 群体并影响与正交方法的比较，因此应明确说明任何分析前处理程序。需提供蛋白质富集和定量的详细信息；如果可能，需包括抗原的阳性和阴性对照 ；如果声称蛋白质与 EV 相关，需要包括 EV 制剂的纯度测量。报告标准化上样、凝胶电泳、转膜方法、探针和成像/分析的所有详细信息（包括但不限于抗体信息、样品变性和还原条件、转膜方法、膜类型、缓冲液以及成像设备和参数）；提供所有WB的未裁剪图像（如果在期刊上发表，则需要作为补充信息）。该指南在以上各章节中，分别讨论了 EV 表征的不同方法，并提供了具体建议。无论采用何种方法，表征的总体建议总结如下：- 每种 EV 制剂应通过 EV 来源的定量测量来定义（例如，分泌细胞的数量、生物流体的体积、组织的质量等）。
- 应估算 EV 的丰度（包括颗粒数量、蛋白质和/或脂质含量）。
- 应检测 EV 制剂是否存在与 EV 亚型或EV 相关的成分，具体取决于实验目的所需的特异性。
- 当使用定量指标表征 EV 时，需提供仪器或方法的检测限 (LOD) 。
