在Liberty BlueTM自动化微波肽合成仪上，可以轻松进行Glu(OAllyl)的正交脱保护和通过内酰胺化实现的肽环化。成功合成了HIV-1抗体表位gp41659-671和Afamelanotide的分支及内酰胺环化变体。四种肽的纯度均在80%到87%之间，每次合成仅需3到3.5小时，且仅产生700到750 mL的总废物。
二、引言
肽链侧链官能团化技术，如生物偶联、分支和环化，是药物开发、医学成像、材料研究等领域中不可或缶夬的重要工具。1-4许多氨基酸残基都可以作为侧链官能团化的位点，其中就包括谷氨酸。
为了顺利实现侧链官能团化，必须为相关残基配备适当的正交保护基，该保护基能够在肽链其余部分不受影响的情况下容易地进行选择性脱保护。对于谷氨酸，常用的保护基是烯丙酯（OAllyl），其脱保护过程需要催化量的Pd(0)和苯基硅烷参与。
图1: Fmoc-Glu(OAllyl)-OH
为了展示Liberty Blue自动化肽合成仪高效合成和官能化肽链的能力，我们合成了HIV-1抗体表位gp41659-671（ELLELDKWASLWN）和Afamelanotide（Ac-SYSNleEHDFRWGKPV-NH2）的分支型和内酰胺环化变体。对于分支型变体，我们将H-Ala-OtBu与正交脱保护的Glu侧链进行偶联。而对于环化变体，我们在线性合成过程中引入了Lys(Alloc)，并在进行内酰胺环化之前，同时对其进行脱保护。
三、材料与方法
试剂
Fmoc-Glu(OAllyl)-OH、Fmoc-Lys(Alloc)-OH、Fmoc-Nle-OH、Fmoc-D-Phe-OH 以及 H-Ala-OtBu • HCl（使用前为游离态）均购自 Novabiochem-MilliporeSigma（马萨诸塞州伯灵顿）。其他氨基酸均购自 CEM Corporation（北卡罗来纳州马修斯），并包含以下侧链保护基团：Asn(Trt)、Asp(OMpe)、Arg(Pbf)、Glu(OtBu)、His(Boc)、Lys(Boc)、Ser(tBu) 和 Tyr(tBu)。Oxyma Pure 和 Rink Amide ProTideTM LL 树脂也购自 CEM Corporation（北卡罗来纳州马修斯）。N,N-二异丙基碳二亚胺（DIC）和羟基苯并三唑（HOBt）购自 CreoSalus（肯塔基州路易斯维尔）。哌啶购自 Alfa Aesar（马萨诸塞州沃德希尔）。苯基硅烷、四（三苯基膦）合钯(0)、乙酸酐、三氟乙酉夋（TFA）、3,6-二氧杂辛烷-1,8-二硫醇（DODT）、三异丙基硅烷（TIS）和乙酸均购自 Sigma-Aldrich（密苏里州圣路易斯）。二氯甲烷（DCM）、N,N-二甲基甲酰胺（DMF）和无水乙酉迷（Et2O）均购自 VWR（宾夕法尼亚州西切斯特）。高效液相色谱（HPLC）级水（H2O）和高效液相色谱（HPLC）级乙腈（MeCN）均购自 Fisher Scientific（马萨诸塞州沃尔瑟姆）。
肽链的合成采用0.1 mmol规模，使用CEM Liberty Blue自动化微波肽合成仪在0.556克Rink Amide ProTide LL树脂（0.18 meq/g取代度）上进行。脱保护反应使用20%哌啶和0.1 M Oxyma Pure在DMF中进行。偶联反应使用5倍过量的Fmoc-AA-OH、1.0 M DIC在DMF中以及1.0 M Oxyma Pure在DMF中进行。Alloc脱保护反应使用0.025 M Pd(PPh3)4在DCM中以及0.50 M苯基硅烷在DCM中进行。通过内酰胺化进行肽链环化反应，使用含0.34 M DIC和0.17 M HOBt的DMF溶液进行。切割反应使用CEM RazorTM高通量肽切割系统，采用92.5:2.5:2.5:2.5 TFA/H2O/TIS/DODT比例进行。切割后，将肽链在Et2O中沉淀并过夜冻干。
注意：这些Alloc脱保护方法所需的钯量比下一节所述方法少，但加热时间更长。
肽链的合成采用0.1 mmol规模，使用CEM Liberty Blue自动化微波肽合成仪在0.556克Rink Amide ProTide LL树脂（0.18 meq/g取代度）上进行。脱保护反应使用20%哌啶和0.1 M Oxyma Pure在DMF中进行。偶联反应使用5倍过量的Fmoc-AA-OH、1.0 M DIC在DMF中以及1.0 M Oxyma Pure在DMF中进行。5Alloc脱保护反应使用0.0312 M Pd(PPh3)4在DCM中以及0.750 M苯基硅烷在DCM中进行。通过内酰胺化进行肽链环化反应，使用含0.34 M DIC和0.17 M HOBt的DMF溶液进行。N端乙酰化反应使用10%乙酸酐在DMF中进行。切割反应使用CEM Razor高通量肽切割系统，采用92.5:2.5:2.5:2.5 TFA/H2O/TIS/DODT比例进行。切割后，将肽链在Et2O中沉淀并过夜冻干。
注意：这些Alloc脱保护方法所需的钯当量比前一节所述方法多，但加热时间较短。
肽链与氨基酸偶联：
将脱保护液（4 mL）加入含有肽的反应容器中，并在90℃下微波照射1分钟。脱保护完成后，用DMF洗涤肽（4 x 4 mL）。然后，向反应容器中加入氨基酸（2.5 mL）、DIC（1 mL）和Oxyma Pure（0.5 mL），在90℃下微波照射2分钟。反应完成后，排空反应容器，为下一次偶联反应准备肽。
肽链与Glu(OAllyl)偶联：
将脱保护液（4 mL）加入含有肽的反应容器中，并在90℃下微波照射1分钟。脱保护完成后，用DMF洗涤肽（4 x 4 mL）。然后，向反应容器中加入氨基酸（2.5 mL）、DIC（1 mL）和Oxyma Pure（0.5 mL），在90℃下微波照射2分钟。反应完成后，排空反应容器，为Glu(OAllyl)脱保护准备肽。
注意：在Glu(OAllyl)引入后，必须立即进行脱保护和功能化处理，以防止因焦谷氨酸形成而导致的非预期封端。
Glu(OAllyl)脱保护：6
用DMF洗涤肽（4 x 4 mL），然后用DCM洗涤（4 x 4 mL）。接着，向反应容器中加入0.500 M苯基硅烷在DCM中的溶液（3 mL）。等待90秒后，向反应容器中加入0.025 M Pd(PPh3)4在DCM中的溶液（1 mL），并在30°C下微波照射12分钟。反应完成后，排空反应容器并用DCM洗涤肽（4 x 4 mL）。重复此步骤两次。完成后，进行两个洗涤操作（4 mL），并用DMF洗涤肽（4 x 4 mL），为侧链偶联准备肽。
侧链偶联：
向反应容器中加入氨基酸（H-Ala-OtBu, 2.5 mL）、DIC（1 mL）和Oxyma Pure（0.5 mL），并在90℃下微波照射4分钟。然后排空反应容器，并加入额外的氨基酸（H-Ala-OtBu, 2.5 mL）、DIC（1 mL）和Oxyma Pure（0.5 mL）。在90℃下再微波照射4分钟。反应完成后，排空反应容器，为下一次偶联反应准备肽。
肽链与氨基酸偶联：
将脱保护液（4 mL）加入含有肽的反应容器中，并在90℃下微波照射1分钟。脱保护完成后，用DMF洗涤肽（4 x 4 mL）。然后，向反应容器中加入氨基酸（2.5 mL）、DIC（1 mL）和Oxyma Pure（0.5 mL），在90℃下微波照射2分钟。反应完成后，排空反应容器，为下一次偶联反应准备肽。
肽链与氨基酸偶联：
将脱保护液（4 mL）加入含有肽的反应容器中，并在90℃下微波照射1分钟。脱保护完成后，用DMF洗涤肽（4 x 4 mL）。然后，向反应容器中加入氨基酸（2.5 mL）、DIC（1 mL）和Oxyma Pure（0.5 mL），在90℃下微波照射2分钟。反应完成后，排空反应容器，为下一次偶联反应准备肽。
肽链与Glu(OAllyl)偶联：
将脱保护液（4 mL）加入含有肽的反应容器中，并在90℃下微波照射1分钟。脱保护完成后，用DMF洗涤肽（4 x 4 mL）。然后，向反应容器中加入氨基酸（2.5 mL）、DIC（1 mL）和Oxyma Pure（0.5 mL），在90℃下微波照射2分钟。反应完成后，排空反应容器，为Glu(OAllyl)和Lys(Alloc)脱保护准备肽。
注意：在Glu(OAllyl)引入后，必须立即进行脱保护和功能化处理，以防止因焦谷氨酸形成而导致的非预期封端。
同时Glu(OAllyl)和Lys(Alloc)脱保护：6
用DMF洗涤肽（4 x 4 mL），然后用DCM洗涤（4 x 4 mL）。接着，向反应容器中加入0.500 M苯基硅烷在DCM中的溶液（3 mL）。等待90秒后，向反应容器中加入0.025 M Pd(PPh3)4在DCM中的溶液（2 mL），并在30°C下微波照射12分钟。反应完成后，排空反应容器并用DCM洗涤肽（4 x 4 mL）。重复此步骤两次。完成后，进行两个洗涤操作（4 mL），并用DMF洗涤肽（4 x 4 mL），为通过内酰胺化进行侧链环化准备肽。
通过内酰胺化进行侧链环化：
将0.34 M DIC和0.17 M HOBt在DMF中的溶液（8 mL）加入反应容器中，并在90℃下微波照射10分钟。然后排空反应容器。此步骤重复两次。完成后，用DMF洗涤肽（4 x 4 mL），为下一次偶联反应准备肽。
肽链与氨基酸偶联：
将脱保护液（4 mL）加入含有肽的反应容器中，并在90℃下微波照射1分钟。脱保护完成后，用DMF洗涤肽（4 x 4 mL）。然后，向反应容器中加入氨基酸（2.5 mL）、DIC（1 mL）和Oxyma Pure（0.5 mL），在90℃下微波照射2分钟。反应完成后，排空反应容器，为下一次偶联反应准备肽。
肽链与氨基酸偶联：
将脱保护液（4 mL）加入含有肽的反应容器中，并在90℃下微波照射1分钟。脱保护完成后，用DMF洗涤肽（4 x 4 mL）。然后，向反应容器中加入氨基酸（2.5 mL）、DIC（1 mL）和Oxyma Pure（0.5 mL），在90℃下微波照射2分钟。反应完成后，排空反应容器，为下一次偶联反应准备肽。
肽链与Glu(OAllyl)偶联：
将脱保护液（4 mL）加入含有肽的反应容器中，并在90℃下微波照射1分钟。脱保护完成后，用DMF洗涤肽（4 x 4 mL）。然后，向反应容器中加入氨基酸（2.5 mL）、DIC（1 mL）和Oxyma Pure（0.5 mL），在90℃下微波照射2分钟。反应完成后，排空反应容器，为Glu(OAllyl)脱保护准备肽。
注意：在Glu(OAllyl)引入后，必须立即进行脱保护和功能化处理，以防止因焦谷氨酸形成而导致的非预期封端。
Glu(OAllyl)脱保护：6
用DMF洗涤肽（4 x 4 mL），然后用DCM洗涤（4 x 4 mL）。接着，向反应容器中加入0.750 M苯基硅烷在DCM中的溶液（2 mL）。等待90秒后，向反应容器中加入0.0312 M Pd(PPh3)4在DCM中的溶液（8 mL），并在35℃下微波照射5分钟。反应完成后，排空反应容器并用DCM洗涤肽（4 x 4 mL）。重复此步骤一次。完成后，进行两个洗涤操作（4 mL），并用DMF洗涤肽（4 x 4 mL），为侧链偶联准备肽。
侧链偶联：
向反应容器中加入氨基酸（H-Ala-OtBu, 2.5 mL）、DIC（1 mL）和Oxyma Pure（0.5 mL），在90℃下微波照射4分钟。然后排空反应容器，并加入额外的氨基酸（H-Ala-OtBu, 2.5 mL）、DIC（1 mL）和Oxyma Pure（0.5 mL）。溶液再次在90℃下微波照射4分钟。反应完成后，排空反应容器，为下一次偶联反应准备肽。
肽链与氨基酸偶联：
将脱保护液（4 mL）加入含有肽的反应容器中，并在90℃下微波照射1分钟。脱保护完成后，用DMF洗涤肽（4 x 4 mL）。然后，向反应容器中加入氨基酸（2.5 mL）、DIC（1 mL）和Oxyma Pure（0.5 mL），在90℃下微波照射2分钟。反应完成后，排空反应容器，为下一次偶联反应准备肽。
N-末端乙酰化：7
将脱保护液（4 mL）加入含有肽的反应容器中，并在90℃下微波照射1分钟。脱保护完成后，用DMF洗涤肽（4 x 4 mL）。然后，向反应容器中加入10% v/v乙酸酐在DMF中的溶液（4 mL），在65℃下微波照射2分钟。反应完成后，排空反应容器并进行洗涤操作（4 mL）。用DMF洗涤肽（4 x 4 mL），为肽的切割准备。
肽链与氨基酸偶联：
将脱保护液（4 mL）加入含有肽的反应容器中，并在90℃下微波照射1分钟。脱保护完成后，用DMF洗涤肽（4 x 4 mL）。然后，向反应容器中加入氨基酸（2.5 mL）、DIC（1 mL）和Oxyma Pure（0.5 mL），在90℃下微波照射2分钟。反应完成后，排空反应容器，为下一次偶联反应准备肽。
肽链与Glu(OAllyl)偶联：
将脱保护液（4 mL）加入含有肽的反应容器中，并在90℃下微波照射1分钟。脱保护完成后，用DMF洗涤肽（4 x 4 mL）。然后，向反应容器中加入氨基酸（2.5 mL）、DIC（1 mL）和Oxyma Pure（0.5 mL），在90℃下微波照射2分钟。反应完成后，排空反应容器，为Glu(OAllyl)和Lys(Alloc)的脱保护准备肽。
注意：在Glu(OAllyl)引入后，必须立即进行脱保护和功能化处理，以防止因焦谷氨酸形成而导致的非预期封端。
同时进行Glu(OAllyl)和Lys(Alloc)的脱保护：6
用DMF（4 x 4 mL）洗涤肽，然后用DCM（4 x 4 mL）洗涤。接着，向反应容器中加入0.750 M苯基硅烷在DCM中的溶液（2 mL）。等待90秒后，向反应容器中加入0.0312 M Pd(PPh3)4在DCM中的溶液（8 mL），并在35℃下微波照射5分钟。反应完成后，排空反应容器并用DCM（4 x 4 mL）洗涤肽。此步骤再重复一次。完成后，进行两次洗涤操作（4 mL），并用DMF（4 x 4 mL）洗涤肽，为通过内酰胺化进行侧链环化准备肽。
通过内酰胺化进行侧链环化：
将0.34 M DIC和0.17 M HOBt在DMF中的溶液（8 mL）加入反应容器中，并在90℃下微波照射10分钟。然后排空反应容器。此步骤再重复两次。完成后，用DMF洗涤肽（4 x 4 mL），为下一次偶联反应准备肽。
肽链与氨基酸偶联：
将脱保护液（4 mL）加入含有肽的反应容器中，并在90℃下微波照射1分钟。脱保护完成后，用DMF洗涤肽（4 x 4 mL）。然后，向反应容器中加入氨基酸（2.5 mL）、DIC（1 mL）和Oxyma Pure（0.5 mL），在90℃下微波照射2分钟。反应完成后，排空反应容器，为下一次偶联反应准备肽。
N-末端乙酰化：7
将脱保护液（4 mL）加入含有肽的反应容器中，并在90℃下微波照射1分钟。脱保护完成后，用DMF洗涤肽（4 x 4 mL）。然后，向反应容器中加入10% v/v乙酸酐在DMF中的溶液（4 mL），在65℃下微波照射2分钟。反应完成后，排空反应容器并进行洗涤操作（4 mL）。用DMF洗涤肽（4 x 4 mL），为肽的切割准备。
四、肽分析
使用配备PDA检测器的Waters Acqity UPLC系统对肽进行分析，该系统配有一根Acquity UPLC BEH C8色谱柱（1.7微米，2.1 x 100毫米）。UPLC系统连接到Waters 3100 Single Quad MS进行结构测定。峰分析在Waters MassLynx软件上完成。分离通过梯度洗脱进行，流动相为0.1% TFA在(i) H2O和(ii) MeCN中。
五、结果
在Liberty Blue自动化微波肽合成仪上，通过微波增强的固相肽合成（SPPS）制备的Glu分支型HIV-1抗体表位gp41659–671的目标肽纯度为82%（图2）。在Liberty Blue自动化微波肽合成仪上，通过微波增强的固相肽合成（SPPS）制备的内酰胺环化型HIV-1抗体表位gp41659–671的目标肽纯度为87%（图3）。在Liberty Blue自动化微波肽合成仪上，通过微波增强的固相肽合成（SPPS）制备的Glu分支型阿法美拉肽的目标肽纯度为85%（图4）。在Liberty Blue自动化微波肽合成仪上，通过微波增强的固相肽合成（SPPS）制备的内酰胺环化型阿法美拉肽的目标肽纯度为80%（图5）。
图2：Glu分支型HIV-1抗体表位gp41659–671的UPLC色谱图
图3：内酰胺环化型HIV-1抗体表位gp41659–671的UPLC色谱图
图4：Glu分支型阿法美拉肽的UPLC色谱图
图5：内酰胺环化型阿法美拉肽的UPLC色谱图
五、结果
Liberty Blue自动化肽合成仪能够简便高效地合成各种功能化的肽。通过执行自动化正交脱保护（及其相关的合成操作），我们合成了HIV-1抗体表位gp41659–671和阿法美拉肽的分支型和内酰胺环化型变体。这四种肽的纯度在80%到87%之间，每个合成过程需要3到3.5小时，每次合成只产生700到750 mL的总废物。
六、引用
(1) Krall, N.; da Cruz, F. P.; Boutureira, O.; Bernardes, G. J. L. Nat. Chem.2016, 8, 103–113.
(2) Boutureira, O.; Bernardes, G. J. L. Chem. Rev. 2015, 115, 2174–2195.
(3) Nielsen, D. S.; Shepherd, N. E.; Xu, W.; Lucke, A. J.; Stoermer, M. J.Fairlie, D. P. Chem. Rev. 2017, 117, 8094–8128.
(4) Wynn, J. E.; Zhang, W.; Falkinham, III, J. O.; Santos, W. L. ACS Med.Chem. Lett. 2017, 8, 820–823
(5) CEM Application Note (AP0124) - “CarboMAX - Enhanced Peptide Coupling at Elevated Temperature.”
(6) Automated Alloc-deprotection adapted from: Wilson, K. R.; Sedberry,S.; Pescatore, R.; Vinton, D.; Love, B.; Ballard, S.; Wham, B. C.;Hutchison, S. K.; Williamson, E. J. J. Pep. Sci. 2016, 22, 622–627.
(7) CEM Application Note (AP0114) - “Automated N-Terminal Acetylation.”
