聚焦细胞凋亡，认识Annexin V的价值

介绍

细胞凋亡（Apoptosis）通常是指机体细胞在发育进程中或者受到某些特定因素影响时，经由细胞内基因及其产物的调控而引发的一种程序性细胞死亡现象。在细胞凋亡的途径里，各个事件的发生具有时序性，依先后顺序逐一出现，最终促成凋亡小体的呈现，接着细胞便发生凋亡。细胞凋亡在胚胎发育与形态发生、维持组织内正常细胞群体的稳定、机体的防御及免疫反应、疾病或中毒引发的细胞损伤、老化以及肿瘤的发生发展等方面都起着至关重要的作用，并且具备潜在的治疗价值。

图1：细胞凋亡途径各时序性事件

检测原理

正常细胞膜的磷脂分布是不对称的，活细胞中磷脂酰丝氨(phosphatidylserine, PS)位于细胞膜的内表面，细胞凋亡时，细胞膜发生变化，PS从细胞膜的内表面翻转到细胞膜的外表面。Annexin V是一种对PS有高度亲和力的、钙依赖性的磷脂结合蛋白，Annexin V可以特异性地识别凋亡细胞表面的PS，而活细胞的PS位于细胞膜的内表面，无法与Annexin V特异性结合。

坏死细胞的PS也会从细胞膜的内表面翻转到细胞膜的外表面，Annexin V也能识别坏死细胞表面的PS，所以Annexin V无法区分坏死细胞和凋亡细胞。而PI染料能够与细胞内的DNA结合，区分坏死细胞和活细胞。早期凋亡细胞和活细胞的细胞膜仍然完整，PI染料无法自由通过细胞膜进入细胞内与DNA结合，所以PI染料无法标记凋亡细胞和活细胞，而PI染料却能够通过坏死细胞的细胞膜与细胞内的DNA结合，坏死细胞内PI染料被488nm激光激发后会发射红荧光，被相应通道接收。所以Annexin V和PI同时使用，就可以区分活细胞、早期凋亡细胞和晚期凋亡或坏死细胞。

图2 Annexin V / PI检测原理

流式细胞术检测

FITC最大激发波长为488 nm，最大发射波长525 nm，FITC的绿色荧光在FL1通道检测；PI-DNA复合物的最大激发波长为535 nm，最大发射波长为615 nm，PI的红色荧光在FL2或FL3通道检测。用CellQuest等软件进行分析，绘制双色散点图，FITC为横坐标，PI为纵坐标。典型的实验中，细胞可以分成三个亚群，活细胞仅有很低强度的背景荧光，早期凋亡细胞仅有较强的绿色荧光，晚期凋亡细胞有绿色和红色荧光双重染色。

图3 流式结果分析

常见问题

Q：Annexin V 细胞凋亡检测可以应用到植物或是细菌（原核生物）吗？

A：可以，但是需要制备原生质体，因为植物细胞或是细菌（原核生物）含有细胞壁，具体的染液使用剂量只需浸没细胞即可，染色时间对于不同细胞有一定的不同。

Q：实验结果如何判断？

A：活细胞（Annexin V-/PI-）、早期凋亡细胞（Annexin V+/PI-）、晚期凋亡细胞和坏死细胞呈现双阳性（Annexin V+/PI+）、裸核（Annexin V-/PI+）。

Q：Annexin V和TUNEL有什么区别？

A：末端脱氧核苷酸转移酶 dUTP 缺口末端标记 (TUNEL) 是一种染色方法，用于识别细胞内 DNA 片段化位点——晚期细胞凋亡的标志性特征。

Annexin V 染色通过结合由于细胞膜不对称性丧失而暴露在细胞外的 PS 残基来识别细胞凋亡的早期阶段。

Q：是否可以仅使用Annexin V-FITC进行检测而不检测PI？

A：可以的。对于特殊的检测样本，如红细胞无细胞核，或使用药物Doxorubicin（阿霉素）对PI检测存在干扰，对于这两种情况可以仅使用Annexin V-FITC进行检测。

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