干货 | 见微知著，PCR那些不为人知的小细节！

PCR（聚合酶链式反应）的原理是DNA要经历变性、退火、延伸步骤才能与引物、DNA聚合酶、dNTP结合形成新的双链DNA分子，但实际需要的目标片段，得在三个循环之后才能得到。因此扩增循环数不能低于3，推荐循环数为30-40个循环。PCR产物的得率计算公式为：

PCR产物得率=2N copies（N代表循环数）

但实际上，随着循环数的增加，体系中的Taq酶、dNTP、引物等逐渐被消耗并伴随着副产物的生成，使得PCR不能呈指数扩增，从而使实际的扩增曲线呈现“S”型，通常分为基线期、指数增长期和平台期三个阶段，如图所示。

PCR扩增曲线

循环数作为一个关键步骤，直接影响PCR反应的结果。

如果DNA模板量较少，而循环次数太少，会导致目标DNA片段扩增产量低。

过多的循环虽然能增加产物量，但会导致反应时间过长，非特异性产物扩增和假阳性的风险也随之上升。一般而言，PCR产物在25～35次循环后即可达最大值，进入“平台期”。随着副产物的积累以及试剂的消耗，即使再增加循环数，PCR产物量也不会再有明显增加，出现扩增无法持续的停滞现象。

图1. 10167扩增576 bp大肠杆菌菌液，基因来源：拟南芥，性能优于竞品。延伸时间为30 sec/kb。循环数34 cycles。

引物设计过程中，需考虑TM值，GC含量、引物长度、引物二聚体的形成，但是往往会忽视3’末端的碱基，小翌建议小伙伴们引物3’末端的碱基最好为G或者C，可以提高引物与模板之间的结合稳定性，降低产物的错配。

正常引物合成的量为2 OD，引物最初为干粉状，依据引物质量添加水至100 μmoL/L浓度（储存液），要使用时稀释10倍至10 μmoL/L浓度（工作液）即可。

在干粉状阶段，务必在3000 rpm/min条件下，离心1 min。如果未离心，在引物寄送的过程中，随着快递的上下翻飞，干粉会挂壁在管内各处，添加的去离子水无法与所有引物混合，导致引物浓度变低，在后续的实验中可能会导致目的片段的少量扩增或无扩增。

那有的小伙伴希望PCR产物量高，多加一点引物可以吗？也是不行的，引物浓度如果过高，易造成错配和非特异性扩增，且引物自身结合的概率增大，更易生成引物二聚体。

如下表显示，10167ES引物添加量的终浓度为0.4-0.5 μM。依据说明书进行实验，PCR实验就可以事半功倍哦~

因为小伙伴的引物作为反复冻融使用的材料，在使用过程中易造成污染，导致非特异扩增，所以小翌建议在使用过程中，引物作为ddH20之后，优先添加的材料，防止因枪头未更换等因素污染引物。

加样步骤推荐：ddH20＞引物＞模板＞Mix酶

Mix酶最后添加：防止因过早添加酶试剂导致引物提早合成引物二聚体，避免非特异扩增，且大部分PCR Mix酶携带指示剂，可以用于区分该试管是否加样完成。

需注意，PCR为冰上操作的实验，但冰块融化之后，如冰水浸没引物、模板管子，易造成交叉污染，导致阴性对照出现假阳性。建议丢弃被冰水浸没过的试剂，更换新试剂做实验。或使用金属冰盒，可避免发生浸没的情况。

模板DNA在储存的过程中会有一定程度的降解，因此放置前测试的浓度不一定准确，为了保证实验精度，在放置一段时间后，需重新测试DNA模板浓度。

小翌提醒，在进行酵母菌P的时候，需尽量将酵母模板处理好，有助于提高PCR扩增效率：酵母菌菌液及菌株煮沸5 min后放入-80℃冰箱3 min，待解冻后上样。

10167ES扩增酵母菌

PCR技术虽然基础，但也需要精确的控制和细心的调整。通过关注这些小细节，可以提高PCR实验的成功率，为你的实验和研究打下坚实的基础。小翌提醒大家，见微知著，每一个小细节都可能成为PCR成功的关键。在分子生物学的世界里，细节往往决定成败。小翌希望能够帮助各位科研工作者更好地理解和掌握PCR技术，从而在研究中取得更好的成果！

2×Hieff® Ultra-Rapid II HotStart PCR Master Mix快速PCR预混液升级版

快速、高效、抑制停滞现象、提高产量

图1. 大肠杆菌菌落极限延伸时间扩增测试，3 kb以内片段10167ES扩增的延伸效率可达1 sec/kb，6 kb片段扩增的延伸效率可达3 sec/kb，6-10 kb片段扩增的延伸效率可达5 sec/kb。M：10,000 DNA Marker（10505ES）。

图2. 长片段+高GC菌液扩增，结果显示10167ES扩增产量高，检出率100%，性能优于竞品。M：10,000 DNA Marker（10505ES）。10167ES扩增速度10 sec/kb，竞品扩增15 sec/kb。