Macrophage polarization regulates intervertebral disc degeneration by modulating cell proliferation, inflammation mediator secretion, and extracellular matrix metabolism
Keywords: inflammation; intervertebral disc degeneration (IDD); low back pain; macrophage polarization; musculoskeletal disorder; nucleus pulposus cells (NPCs).
椎间盘退变（IDD）过程与合成代谢和分解代谢之间平衡稳态的转变有关，因此，它导致细胞外基质（ECM）组分的分泌减少，特别是聚集蛋白聚糖和II型胶原纤维蛋白，并增强基质金属蛋白酶（MMPs）的表达。此外，IDD 的进展伴随着各种促炎细胞因子水平的显著升高，包括白细胞介素（IL）-1α 、IL-6、IL-8 和 IL-12 以及肿瘤坏死因子（TNF）-α。因此，促进 ECM 成分的分泌以及抗炎反应是对抗 IDD 的关键。
在 IDD 中，由于免疫平衡被纤维环破裂或终板微骨折破坏，巨噬细胞浸润和极化发生。越来越多的细胞共培养模型发现，髓核细胞（NPCs）和巨噬细胞可以改变炎症因子的表达，如炎症相关基因（IL-1β、IL-6 和 Ccl3）和 ECM 代谢相关基因（MMP13 和 Acan）。根据对微环境刺激的反应，巨噬细胞分为经典活化的M1巨噬细胞和交替活化的M2巨噬细胞。然而，巨噬细胞极化对 NPCs 的作用及其在 IDD 中的潜在机制尚未明确。
鉴于此，广东省高州市人民医院骨外科课题组曾在一项研究中，探讨了人 IDD 样本中巨噬细胞极化标志物的表达，并在细胞共培养模型中测试了它们对 NPCs 的生物学效应，还进行了差异表达基因（DEGs）的鉴定和通路分析，以阐释巨噬细胞极化的生物学作用，探索与 IDD 相关的潜在分子靶点和信号通路。研究成果发表在 Frontiers in Immunology 期刊题为“Macrophage polarization regulates intervertebral disc degeneration by modulating cell proliferation, inflammation mediator secretion, and extracellular matrix metabolism”。
首先，利用免疫组化分析评估了退行性椎间盘（IVD）组织中巨噬细胞的积累和极化，测定了对照（Pfirrmann I 级）和退变样本（Pfirrmann IV 级）中M1和M2巨噬细胞标志物CCR7和CD206（图1 A）。与对照组相比，裂缝或肉芽 IDD 组织样本显示更高的 CCR7（M1 样巨噬细胞标志物）阳性细胞计数（图1 B、C），且M2 样巨噬细胞标志物 C206+ 阳性细胞的比例也显著升高（图1 D、E）。这表明，与正常对照相比，IDD 患者 IVD 退变组织中 M1 和 M2 极化巨噬细胞均有浸润和累积。
图1 巨噬细胞在人IVD组织中的积累和极化。（F）条件培养基（CM）的收获流程及体外、体内条件培养基的分组过程。对于细胞共培养模型，将 NPCs 分为 5 组：第1组以 10% FBS 培养基处理为对照，第2组以 10 ng/mL TNF-α 为阴性组，第3-5组分别以 10 ng/mL TNF-α 和 30% M0CM、M1CM、M2CM 作为共培养组。
接下来，通过 EDU 掺入和 CCK-8 测定分析了 NPC 的增殖。结果显示，对照组、TNF-α-、M0CM+ TNF-α-、M1CM+ TNF-α-和M2CM+ TNF-α-组在24 h和48 h时EDU阳性细胞百分比和光密度（OD）值均无显著差异，然而，在 72 h和 96 h时，TNF-α处理组在两个测试中均显示 NPC 增殖降低（图2）。在检测 TNF-α 环境中 EDU 阳性细胞的比例时，M1CM 共培养呈抑制趋势，而 M2CM 共培养呈促进趋势，96 h 时该比例显著高于 TNF-α处理组（图2 B）。同样，在 TNF-α 处理后，M2CM 共培养显示 NPC 细胞增殖增加，而 M1CM 共培养显示出相反的结果（图2 C）。这些发现表明，M1CM 抑制了细胞增殖，而 M2CM 逆转了这种作用。
此外，通过免疫荧光分析了NPCs中II型胶原的表达。实验观察到，与对照组相比，TNF-α 处理降低了 OD 值。与 TNF-α处理组相比，M1CM 共培养组显示 OD 值明显降低，而 M2CM 共培养组显示 OD 值增加。同时，蛋白质印迹分析显示合成代谢蛋白Aggrecan（聚集蛋白聚糖）在 TNF-α 环境中表现出相同的趋势，相反，分解代谢蛋白 MMP-13 在 M1CM 组中表达更高，M2CM 组表达较低。相对于对照组，TNF-α处理组编码Aggrecan和COL2a1的 ECM 相关基因的表达显著下调，而 M2CM 显著上调其表达水平。相比之下，M1CM+ TNF-α 组COL1a1和 MMP-13 表达上调，而 M2CM 共培养组在这方面呈下降趋势。所有 TNF-α处理组的 IL-1β、IL-6 和 IL12 基因表达水平均显著高于对照组。与 TNF-α处理的 NPCs 相比，M1CM 共培养的 NPCs 显示 IL-1β、IL-6 和 IL12 基因表达水平显著上调，而M2CM 共培养的 NPCs 均显著下调其水平。这些结果表明，M1CM 处理减弱了 IDD 中 ECM 合成并促进了促炎介质的分泌，而在 M2CM 处理的情况下观察到相反的趋势。
图2 巨噬细胞极化对TNF-α-处理环境下NPCs增殖的影响。
为了进一步评估不同 CMs 对 IDD 进展的治疗效果，对大鼠 IDD 模型进行局部CM 注射。8 周后，阴性对照（NC）组形态紊乱，髓核（NP）在椎间盘区域明显变窄，M1CM 注射后 NP 组织质量以及外纤维环（AF）薄板破坏呈加重趋势，退变相关变化明显严重，而M2CM 可以明显抑制这种与退变相关的变化。通过 X 射线分析获得椎间盘高度指数（DHI）值，发现M1CM 注射导致 DHI 持续降低，而 M2CM 注射相对于 NC 组在整个实验期间显著抑制了这种 DHI% 的下降趋势。这表明，M1CM注射促进了IDD进展，而M2CM处理则表现出相反效果。
然后，还评估了巨噬细胞极化对椎间盘基质的影响。免疫组化染色显示，未穿刺的 IVD 空白对照（BC）组对应的 AF 和 NP 对II 型胶原蛋白和聚集蛋白聚糖呈强阳性，然而，NC 组在穿刺后 8 周染色强度显著降低（图3 B、C）。此外，M1CM 下调II 型胶原蛋白和聚集蛋白聚糖的表达，然而这种效果被 M2CM 处理抑制（图3 B、C），基因表达分析结果与此一致（图3 D、E）。
此外，穿刺后 8 周 ECM 分解代谢和促炎介质相关基因的表达分析显示，NC 组相对于 BC 组 MMP13 显著上调（图3 F）。相较于NC 组，M1CM 组 MMP13 mRNA 水平和促炎介质 IL-1、IL-6 和 IL-12 的表达水平均升高，而M2CM 组表达水平均呈相反趋势（图3 F-I）。这些数据表明，M1CM 对 IDD 具有破坏性作用，而 M2CM 可以减轻这种影响。
图3 巨噬细胞极化对大鼠尾骨IVDs ECM代谢及促炎介质分泌的影响。
最后，研究人员对TNF-α环境下与巨噬细胞共培养的NPCs进行了差异表达基因（DEGs）鉴定。与 TNF-α 组比较，M1CM+ TNF-α 组共检测到637 个上调基因和 655 个下调基因，其中上调最多的是ETS 同源因子（EHF），下调最多的是壳多糖酶3样蛋白1（CHI3L1）；M2CM+ TNF-α 组共检测到 975 个上调基因和 930 个下调基因，其中上调最多的是 EHF，下调最多的是 Homo_sapiens_newGene_100589。
通过GO和KEGG通路富集分析，还在两组中检测到细胞器裂变、核分裂和染色体分离等多个GO terms 富集，其中 KEGG 通路分析中最重要的通路是细胞周期。此外，M2CM 组含胶原的细胞外基质、DNA催化活性和细胞外基质结构成分均高度富集。这与上述结果相吻合，即 M2CM 通过抑制 TNF-α诱导的 ECM 降解来减缓 IDD，表明其具有促进 ECM 合成的潜力。
通过构建蛋白质-蛋白质相互作用（PPI）网络鉴定中心基因（hub基因）发现，在M1CM组中，较显著的5个中心基因分别是PLK1、KIF20A、RRM2、CDC20和UBE2C；M2CM组中较显著的5个中心基因分别是RRM2、CDC20、CCNB1、PLK1和UBE2C。这些生物信息学分析鉴定表明其是与IDD相关的中心基因，可为治疗IDD提供研究方向。
图4 M1 和 M2 巨噬细胞在 IDD 过程中的作用和潜在机制。巨噬细胞主要以极化的M1 和 M2 参与 IDD，而不是以其自身。具体而言，M1CM 抑制细胞增殖并加剧 IVD 退变，而 M2CM 促进细胞增殖并减弱 IDD 的发展。在 M1CM 处理的 NPCs 中共鉴定出 1038 个 DEGs，在 M2CM 组中共鉴定出 1905 个 DEGs。细胞周期是 KEGG 富集较显著的通路，在两种处理的 NPCs 中，细胞器裂变、核分裂和染色体分离均在 GO 功能中高度富集。最后，M1CM 组最重要的 5 个基因为 PLK1、KIF20A、RRM2、CDC20 、UBE2C；M2CM 组为 RRM2、CCNB1、CDC20、PLK1 和 UBE2C。
总之，巨噬细胞极化在 IDD 进展中发挥了不同的作用，M1CM 抑制了细胞增殖，加剧了 IVD 退变，而 M2CM 则减缓了 IDD 的发展。这些发现可能有助于进一步阐明巨噬细胞极化在 IDD 中的作用，并为巨噬细胞的治疗潜力提供新的见解。
参考文献：Li XC, Luo SJ, Fan W, Zhou TL, Tan DQ, Tan RX, Xian QZ, Li J, Huang CM, Wang MS. Macrophage polarization regulates intervertebral disc degeneration by modulating cell proliferation, inflammation mediator secretion, and extracellular matrix metabolism. Front Immunol. 2022 Aug 18;13:922173. doi: 10.3389/fimmu.2022.922173. PMID: 36059551; PMCID: PMC9433570.
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