Q1. 细胞如何贴壁或者固定好？
这是第一步，也是基础和关键的一步，这是基础，基础不好，后面一切都是白搭。
对于贴壁细胞: 先将洁净的爬片片在 70%乙醇中进行浸泡处理，然后用干净无菌的镊子放置到培养皿中，用无菌 PBS 洗去残留的乙醇。待细胞接近长成单层后取出盖玻片(一般都是过夜培养)操作小心，防止细胞脱片。
对于悬浮细胞: 如果能像贴壁细胞一样，那就好了。传统这是一个痛点待解决，其实新的方法就是使用靶点科技（Biotarget）的悬浮细胞免疫荧光专用玻片。让悬浮细胞简单四步，就能像贴壁细胞一样固定好，主要是，细胞还是活的，还可以刺激。
Q2. 如何避免多种染色互串？
*细胞不能铺的太密，细胞稀释一下，浓度不能太高，尽可能用大体积来铺细胞。太密就导致一抗结合蛋白增多，更容易出现非特异性染色，且细胞太密，显微镜拍照出来的效果就会很一般，一般6孔板满孔的贴壁细胞，取1/8的量铺到带有爬片的12孔板里，大概12小时后，细胞密度就刚刚好。悬浮细胞，直接用靶点科技的悬浮细胞免疫荧光专用玻片就行。双抗体染色时可不用活细胞染核液（Hoechst），也就是不要最开始染核，放到最后封片时，用DAPI染，DAPI浓度不要过高，核很容易被染色，低浓度染色即可。
*支原体清除后再做IF。用状态好，未被污染的细胞去做IF，状态好的细胞伸展很开，染色效果也更好，若细胞支原体污染，可能会产生背景脏，图像不完整等现象，非特异性染色严重且去不掉，染核染抗体都会被染上乱七八糟的东西。
*一抗浓度的问题。双抗体染色若外转质粒，可染标签抗体，标签抗体更特异且使用浓度低，一般都在1：500左右；若染内源性蛋白，浓度可1：200，做之前记得看下抗体说明书该抗体是否可以做IF；4度过夜染效果更好，一抗可回收，负20保存，大概可用3次，根据抗体灵敏度决定使用次数；双抗体IF，一定要用不同来源的的抗体，一个用鼠，一个用兔，最好不要双鼠或者双兔的。
*二抗：常温孵育1～2h，避光，避开同属性的二抗，洗涤一抗可用pbs，洗涤二抗可以用tbst，多加一些吐温。吐温可以洗涤掉非特异结合的抗体，多洗几次。
*拍摄：封片后拍摄时，可以适当缩短激发光波长，使其没有交叉波长。比较好的选择：绿光488，红光555。重合的波谱，就会不单纯激发。拍出来就不单纯。
