想做好血液RNA-seq实验？这些经验请收好！

血液是一种信息量巨大、获取方便且微创的样本类型，广泛用于诊断和临床研究，以探索疾病的病理和生理机制以及疗法的作用。全血转录组测序是一种基于RNA测序（RNA-Seq）的方法，可对全血进行深入的基因表达谱分析，深入了解全系统范围内所有转录本的表达和丰度。高通量RNA-Seq技术的发展使我们能够以较低的成本收集高质量的血液转录组信息，为发现生物标志物、了解药物反应、病理和生理过程以及疾病的无创诊断带来了革命性的变化。

外周血的优势在于采集快捷，且可在大规模人群中实现。然而，一旦血液离开人体，问题就来了。传统方法需要从全血中分离白细胞，再提取RNA，以解决血液中污染物的问题。如今，专门为制备血液样本而开发的方案使我们能够从全血中获得高质量的RNA-Seq 数据。

什么是RNA-seq？ 

RNA-seq即转录组测序技术（Transcriptome sequencing），广义的定义为：对细胞内所有RNA（包括rRNA/ tRNA/ mRNA等）进行高通量测序，狭义的定义为：对细胞内mRNA进行高通量测序，临床检验实验室指的一般为狭义的转录组测序。

血液样本

任何血液转录组分析实验的第一步都是通过静脉穿刺或指针采血。从少量血液中获取优质RNA的技术进步，如通过指针采样，将使广泛的研究成为可能，参与者甚至可以进行自我采样。

血液RNA降解可能发生在采集、储存和处理过程中，因此，血液排出体外后，必须防止或减少RNA降解。而血液RNA极易降解的原因之一是血浆中含有高浓度的RNA酶（RNase）。在一项研究中，血浆内的游离RNA仅在15 秒钟就发生降解，导致无法进行实时PCR扩增，RNA酶的威力由此可见一斑。因此，在采集全血时立即抑制RNA酶的活性至关重要，这样才能确保采集高质量的RNA，这对下游测序、生物标记物鉴定和疾病诊断至关重要。

为了降低RNA的降解，特别是在开展大规模血液转录组学项目时，我们建议使用专门RNA采血管收集血液，如PAXgene™全血RNA 采血管（BD, 762165）。该采血管含有能稳定 RNA 的专有试剂，能产生准确反映采样时血液状态的基因表达数据。

更重要的一点，采血管的样本储藏时间及RNA质量的稳定性，是大型多中心临床研究的一个关键考虑因素。PAXgene全血RNA保存管（762165）内含能够稳定体内基因转录性状的抗凝剂。抗凝剂能够减少RNA在体外的降解，稳定细胞内的RNA，并将基因诱导的水平降低到最小程度，被广泛用于血液RNA样本的保存。相关实验证明，PAXgene™ 全血RNA 采血管中样本在-80℃储存7年后 ，提取的RNA 质量与产量均较稳定，样本在-20℃中储存11年后，RNA 质量与采集当天相比没有降低。

另外，如下图所示，在没有珠蛋白耗竭的情况下，基因检测率会降低。从血液中分离的RNA样本中去除rRNA及珠蛋白mRNA，可释放出更多宝贵的测序空间，并将测序读数集中到最重要的部分。