前 言
慢病毒载体使得真核细胞基因修饰、表达变得更简单，在实验室研究、工业生产和临床治疗中应用越来越广泛。比如第三代自灭活慢病毒载体用于造血干细胞的基因修饰，治疗原发性免疫缺陷和血红蛋白病。慢病毒载体作为CAR转导T细胞的载体，是CAR-T细胞生产过程中的关键原料，对实现大规模生产、缩短生产周期具有重要意义。
01慢病毒载体和CAR-T
慢病毒载体是一种源于人类免疫缺陷病毒（HIV）的基因载体。在构建慢病毒载体时，为了避免产生有复制能力的病毒，会把HIV-1基因组分装与不同的质粒中，再共转染细胞，获得只有一次感染能力而无复制能力的慢病毒载体。目前慢病毒载体已从两质粒系统发展到四质粒系统，安全性不断提高。目前常用的是四质粒系统，有更广泛的应用，比如基因编辑、基因治疗、转基因动物、药物研究、CAR-T细胞治疗等。
慢病毒载体有更广泛的宿主，能够感染分裂和非分裂细胞。对于难转染的细胞，如原代细胞、干细胞、不分化的细胞等，能极大的提高目的基因的转导效率。慢病毒可以将外源基因有效的整合到细胞染色体中，在靶细胞中获得持续高效稳定的表达。慢病毒载体还可以携带5kb以上的目的基因，将cDNA克隆到慢病毒载体中。
慢病毒载体的生产和用途示意图（源自参考文献）
CAR-T细胞治疗在多种癌症的临床上取得成功，是目前医学研究前沿热门的方向之一。CAR-T生产制备流程主要包括T细胞富集、分化、扩增，通过病毒或非病毒载体进行CAR基因转移，然后再进行体外CAR-T细胞扩增，最终制成细胞产品。因此将特定的CAR基因转导进入T细胞的病毒载体是整个生产过程的关键原料。目前大部分CAR-T细胞的制备使用慢病毒载体，如诺华的Kymriah和Juno的Breyanzi，依靠慢病毒载体完成CAR-T细胞制造。
CAR-T细胞治疗示意图（源自参考文献）
02慢病毒载体生产制备
慢病毒载体作为CAR-T的核心环节，其质量对细胞产品及其治疗效果具有直接影响。虽然生产慢病毒载体的步骤并不复杂，但如何大规模生产符合cGMP要求的高质量慢病毒载体仍具有挑战性。
慢病毒的生产是一个持续几天的细胞培养过程，将病毒载体转移到培养基中。主要有贴壁和悬浮两种培养方式。小规模研究可以选择贴壁培养，但大规模生产需要悬浮培养。
慢病毒的大规模生产常用HEK293T细胞系，可以在没有贴壁的情况下迅速悬浮生长。将包装细胞在培养基中传代数次，达到一定数量后，用病毒包装质粒和目的基因载体质粒共转染细胞。在几天的培养过程中，包装细胞会产生大量慢病毒颗粒，可以从培养基中收获。病毒载体纯化可使用多种方法，例如梯度纯化法或色谱法。
除了细胞系，慢病毒的悬浮无血清培养已逐步替代传统的贴壁培养模式。悬浮培养能够降低成本和污染风险，培养及纯化步骤更简单，更容易放大。在成本方面，培养基是不可忽略的因素，选择来源和化学成分明确、不含血清的培养基，会极大的降低成本和简化下游纯化工艺，并降低污染风险。义翘神州已成功开发多款适用于HEK293细胞悬浮培养的无血清培养基，属于无血清、无抗生素、无动物源性组分的即用型培养基，可用于慢病毒载体大规模悬浮培养。
大规模生产还需要考虑杂质去除，比如宿主DNA，在200L的反应器中需要750mg的质粒DNA，意味着转染过程中会有大量的残留，因此需要选择合适的核酸酶进行去除。
总的来说，理化性质不稳定，回收率低，培养体系和纯化工艺等未攻克的问题，依旧是慢病毒规模化生产的瓶颈和关键。
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参考文献：
1. Xiaoyu Wang, et al. Recent advances in lentiviral vectors for gene therapy.
2. Natalia Elizalde and Juan Carlos Ramírez. Lentiviral vectors: key challenges and new developments.
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4. David Escors, Karine Breckpot. Lentiviral vectors in gene therapy: their current status and future potential.
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