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【摘要】 　　目的：构建含人肝细胞生长因子（hHGF）基因的骨髓间充质干细胞（MSCs），获得高表达hHGF的MSCs。方法： 构建含hHGF基因的腺病毒表达载体pDC316HGFIRESEGFP。同源重组法获得含hHGF的重组腺病毒AdHGF。以仅表达GFP基因的重组腺病毒AdGFP为对照，体外分别以AdGFP, AdHGF感染MSCs。荧光激活细胞分选术检测受染细胞的基因表达效率。酶联免疫吸附测定法检测转导细胞培养上清中hHGF表达的浓度和持续时间。结果： 腺病毒表达载体经限制性内切酶切后有2.2 kb的hHGF目的基因片段和5.2 kb的线性化载体片段;目的片段测序结果与基因库中hHGF cDNA序列一致。病毒液AdHGF纯化后滴度可以达到8.02×1010 pfu/ml。FACS检测HGF/MSCs的GFP阳性率达95.19%。HGF/MSCs细胞培养上清中hHGF能持续表达至少14 d;zui高浓度达到99 ng/ml。结论： 本实验中腺病毒表达载体构建正确;重组腺病毒液AdHGF滴度高;转导后在MSCs中获得、稳定和持续表达的hHGF。该载体达到实验设计要求，为进一步的体内外研究提供了实验依据。

　　【关键词】 间充质干细胞; 　 肝细胞生长因子; 腺病毒载体

　　Construction of hepatocyte growth factor expression vector system　and expression in rat bone marrow mesenchymal stem cells

　　ZHU Yuerong, XING Jicheng, HAN Ping, QIU Hong

　　（Department of Biochemistry, the 81st Hospital of PLA, Nanjing Jiangsu 210002;Medical Firstaid Center, Nanjing Lukou International Airport, Nanjing Jiangsu 210029,China）

　　[Abstract]Objective: To construct the adenoviral expression vector system containing human HGF cDNA, and produce the virus containing hHGF, and to further study the transducing efficiency and the expression of HGF in MSCs. Methods： The HGF cDNA was amplificated from the expression plasmid pCMVHGF by PCR，and subcloned into the same site of the plasmid pDC316IRESEGFP vector. The recombinants, named pDC316HGFIRESEGFP, were identificated with restriction enzyme digestion and sequencing. Then we produced virus AdHGF and AdGFP by homologous recombination in HEK293 package cells. BMMSCs were transduced with AdHGF， and HGF/MSCs were generated. The efficiency of AdHGF transduction was assessed by FACS analysis. The HGF concentrations in supernatants of HGF/MSCs were determined by ELISA. Results： The recombinants pDC316HGFIRESEGFP contained fragments of hHGF. The DNA sequencing of HGF was identical to the report in Genbank. After packing of the pDC316HGFIRESEGFP in HEK293 cells, 8.02×1010 pfu/ml titer of AdHGF was obtained. Fortyeight hours after transduction, 95.19% of HGF/MSCs were GFP positive， and peak concentration levels of hHGF in the cultured supernatants were detected. The adenovirusmediated expression of HGF by MSCs was maintained for at least 2 weeks in vivo. Conclusion： Our data demonstrated that the adenoviral expression vector system pDC316HGFIRESEGFP containing hHGF cDNA had been constructed correctly, and its effective expression also had been obtained in MSCs. It will provide material basis for the next study.

　　[Key words]mesenchymal stem cells; hepatocyte growth factor; adenoviral expression vector

　　间充质干细胞（MSCs）在与肝细胞体外共培养时，有促进肝细胞生长的作用;在特定条件下，能分化为肝脏细胞。将其移植到体内也能促进肝细胞的生长，促进损伤的肝脏尽快恢复[1]。同时MSCs是携带外源基因的良好载体。肝细胞生长因子（HGF）是目前*zui强的肝脏再生剂，通过多种途径发挥对肝脏的保护作用：促进肝细胞再生，改善肝功能和减轻肝损害，在临床和实验研究中被广泛应用[2]。在体外，HGF是干细胞向肝细胞分化的zui关键细胞因子。在体内，HGF能促进活化的肝脏干细胞迁移至肝实质，这些干细胞在肝内定植并进一步分化为肝细胞[3]。

　　本研究旨在构建高表达人肝细胞生长因子（hHGF）的MSCs（HGF/MSCs），为下一步用HGF/MSCs治疗肝硬化提供实验依据。

　　1 材料和方法

　　1.1 实验材料

　　1.1.1 质粒与细胞

　　含人全长HGF基因的质粒pCMVHGF由南京医科大学*附属医院肝脏外科俞悦博士惠赠。腺病毒载体穿梭质粒pDC316IRESEGFP、骨架质粒pBHGloxE1 3Cre及其包装系统AdMaxTM购自北京本元正阳基因技术有限公司。

　　1.1.2 主要试剂

　　转染用试剂Lipofectamine购自Invitrogen生物技术公司;小鼠抗大鼠CD34单克隆抗体：美国Santa Cruz Biotechnology公司;小鼠抗大鼠CD90，CD11b/c, CD29单克隆抗体：美国BioLegend公司;小鼠抗大鼠CD45，CD54单克隆抗体，小鼠IgG1 kappa单克隆抗体：美国Catag Laboratories公司;成年Lewis大鼠（雌雄不限，体质量180～230 g），由北京维通利华实验动物技术有限公司提供。

　　1.2 实验方法

　　1.2.1 MSCs的分离与鉴定[4]

　　无菌条件下分离Lewis大鼠股骨、胫骨，去除软组织，切除股骨两端，用含肝素（20 U/ml）的PBS液冲出骨髓，轻轻混匀，使充分散开;利用密度梯度离心法分离MSCs。获取单个核细胞，调整细胞浓度为1×105个/ml后，25 cm2培养瓶中培养、传代。整个实验选用3～6代细胞，以确保MSCs的纯一性和未分化性。

　　MSCs可表达多种表面抗原MSCs[5],我们选取CD34,CD29,CD45,CD11b/c,CD90,CD54作为其鉴定标记。被测细胞浓度用含1%FBS的PBS缓冲液调节至（0.5～1）×106/ml，吸取50 μl标本，加入单克隆抗体10 μl，室温下与相应单抗避光孵育20 min。PBS洗2遍后加入0.5 ml PBS将细胞打匀，应用FACS检测BMMSCs表面标志。用抗小鼠IgG1FITC,IgG1PE标记的细胞作为阴性对照，每次分析2万个细胞。

　　1.2.2 穿梭质粒pDC316HGFIRESEGFP的构建

　　设计带上游AgeI、下游带入NheI的引物，以pCMVHGF为模板保真扩增HGF基因。引物序列如下：HGFAgeIF：5′TAAACTATACCGGTATGTGGGTGACCAAACTC3′;HGFNheIR：5′TAAACTATGCTAGCCTATGACTGTGGTACCTT3′。PCR产物用AgeI+NheI双酶切，酶切后回收约2 kb的片段，此为片段（1）。AgeI+NheI双酶切pDC316IRESEGFP质粒，回收约5 kb的大片段，此为片段（2）。连接片段（1）、（2），转化感受态DH5α细胞，筛选及小提质粒后，再用AgeI+NheI双酶切，并经测序鉴定，获得重组子pDC316HGFIRESEGFP。

　　1.2.3 HGF基因腺病毒重组体AdHGF的包装

　　采用细胞内质粒DNA同源重组法：将HEK293细胞接种于6孔细胞培养板，5×105细胞/孔，培养24 h后，取骨架质粒（4 μg）和穿梭质粒pDC316HGFIRESEGFP（1 μg），用LipofectAMINE脂质体按说明书进行转染。获得第1代毒种，作为随后大量病毒扩增的毒种。

　　在HGF基因的中间部位设计鉴定引物，引物序列为：HGFF：5′GCCAGAGCTCATGTGGGTGAC3′,HGFR：5′CTGCGTCGACCTGAGGAATGTC3′。扩增长度为600 bp。取50 μl毒种上清液，进行PCR鉴定，检测重组腺病毒中是否插入目的基因hHGF。重组腺病毒毒种扩增与纯化后，用经典方法测定病毒制品的TCID50值，分装保存于-70 ℃冰箱中。

　　1.2.4 AdHGF转染MSCs

　　实验分为3组：转染AdHGF的实验组，转染AdGFP空载体的阴性对照组，不加病毒的空白对照组。转导前24 h，收获MSCs细胞，以3×105个/孔的密度接种于6孔板中。转导时吸去培养基，加入5 ml培养基（含AdHGF或AdGFP 100 μl），CO2孵箱培养6 h后补液至10 ml。72 h 后，按1∶3 传代。用FACS检测转染细胞GFP表达，判断HGF基因的转染效率。

　　1.2.5 ELISA法检测细胞培养上清hHGF水平

　　MSCs经AdHGF，AdGFP转染后，所得细胞分别命名为HGF/MSCs，GFP/MSCs。收集不同时间点（0,2,4,6,8,10,12,14天）的细胞培养上清，以MSCs为空白对照，检测其中hHGF浓度。

　　2 结果

　　2.1 MSCs的分离、培养和鉴定

　　FACS结果证实我们分离培养的6代以内细胞均只表达CD29,CD54,CD90，而造血干细胞、成纤维细胞、单核细胞及巨噬细胞各自特异性表达的标记CD34,CD45,CD11b/c均呈阴性表达。这群细胞特性稳定，扩增一代和两代后的细胞同质性分别达到96.18%,93.59%和98.63%（图1）。

　　2.2 穿梭质粒pDC316HGFIRESEGFP的鉴定结果

　　pDC316HGFIRESEGFP经AgeI+NheI双酶切，琼脂糖凝胶电泳，可见一大小约2.2 kb的DNA片段（图2a），与hHGF基因大小一致，表明目的基因已成功克隆至穿梭质粒pDC316HGFIRESEGFP中。将鉴定正确的质粒送测序。其HGF片段测序结果与基因库NM001010932碱基序列*吻合（图2c）。毒种PCR结果能够特异地扩增出预期大小的条带，证明该重组腺病毒携带目的片段（图2b）。

　　2.3 重组腺病毒（AdHGF）的构建

　　pDC316HGFIRESEGFP转染HEK293细胞后，几乎所有HEK293细胞都表达GFP蛋白（图3b）。通过快速CPE确定病毒的感染滴度（pfu/ml）为8.02×1010。效价比（病毒颗粒数/病毒感染滴度）为28。

　　2.4 AdHGF感染MSCs的效率和HGF水平

　　2.4.1 转染效率

　　AdHGF感染MSCs细胞后，95.19%的MSCs细胞都表达GFP蛋白（图4a）。空白对照组不表达荧光，转染AdGFP空载体的阴性对照组MSCs（图4b）和转染AdHGF的MSCs（图4c）均表达荧光。

　　2.4.2 细胞培养上清中HGF水平

　　MSCs，GFP/MSCs细胞的培养上清中hHGF均不表达，而HGF/MSCs细胞培养上清中hHGF呈阳性表达，zui高浓度达到99 ng/ml （图），且持续表达时间至少14天（图5b）。

　　3 讨论

　　HGF在体内分布广泛，具有多种生物学特性，不仅能刺激肝细胞的再生，促进肝功能恢复，而且可改善肝纤维化，在损伤因子刺激时保护肝细胞[6]。HGF与其受体cmet结合后，调节细胞的增殖、分化、运动和血管生成等[7]。HGF的作用贯穿于整个肝脏的发生、发展及肝再生的过程[8]。但外源性HGF蛋白在体内半衰期短，约15 min，所以即使高频率多次重复输注，也不可能维持体内高水平的HGF。而且需要的HGF用量以及经济上的花费都是巨大的。将HGF基因导入合适的细胞，利用细胞自分泌的HGF，是针对HGF蛋白以上不足的有效措施。

　　腺病毒载体制备方便，产生的重组病毒滴度高，是常用的载体。采用新型AdMax包装体系，可以稳定、快速分泌高滴度的重组病毒，可直接用于感染靶细胞。腺病毒转染宿主细胞后，外源基因至少持续表达2周，同时不整合入宿主细胞。

　　有文献报道构建了携带hHGF基因的逆转录表达载体plEGFPHGF、真核表达载体pEGFPHGF[9，10]，可有效转染MSCs细胞并发挥生物效应。但在研究中发现，重组质粒的转染效率较低,逆转录表达载体其培养上清中hHGF产量低。而腺病毒载体高转染率、高蛋白产量的特点可能会达到理想的效果，本研究我们构建了携带人HGF基因的重组腺病毒，并获得了高表达hHGF的MSCs。为下一步将HGF/MSCs移植于肝硬化模型，利用HGF达到促进肝再生和细胞保护作用及进一步的体内研究提供极大的便利。