Western Blotting实验操作培训三圻明生物资料

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转移后的硝酸纤维素膜就称为一个印迹（blot），用于对蛋白质的进 一步检测。印迹
首先用蛋白溶液（如10％的BSA）处理以封闭硝酸纤维素膜上剩余的疏水结合位点，而后用
所要研究的蛋白质的抗血清（一抗）处理，印迹中只有待研究的蛋白质与一抗结合，而其它
蛋白质不与一抗结合，这样清洗去除未结合的一抗后，印迹中只有待研究的蛋白质的位置上
结合着一抗。处理过的印迹进一步用适当标记的二抗处理，二抗是指一抗的抗体，如一抗是
从鼠中获得的，则二抗是抗鼠Ig G 的抗体。处理后，带有标记的二抗与一抗结合，可以指
示一抗的位置，即是待研究的蛋白质的位置。目前有结合各种标记物的抗特定Ig G 的抗体
可以直接购买作为标记的二抗。zui常用的一种是酶连的二抗，印迹用酶连二抗处理后，再用
适当的底物溶液处理，当酶纯化底物生成有颜色的产物时，就会产生可见的区带，指示所要
研究的蛋白质的位置。在酶连抗体中使用的酶通常是碱性磷酸酶或辣根过氧化物酶。碱性磷酸酶可以将无色的底物5-溴-4-氯吲哚磷酸盐（BCIP）转化为蓝色的产物；而辣根过氧化物
酶可以以H2O2 为底物，将3-氨基-9-乙基咔唑氧化成褐色产物或将4-氯萘酚氧化成蓝色产
物。另一种检测辣根过氧化物酶的方法是用增强化学发光法，辣根过氧化物酶在H2O2 存在
下，氧化化学发光物质鲁米诺（luminol，氨基苯二酰一肼）并发光，在化学增强剂存在下
光强度可以增大1000 倍，通过将印迹放在照相底片上感光就可以检测辣根过氧化物酶的存
在。除了酶连二抗作为指示剂，也可以使用其它指示剂，主要包括以下一些：
I125 标记的二抗：可以通过放射性自显影检测。
荧光素异硫氰酸盐标记的二抗：可以通过在紫外灯下产生荧光来检测。
I125 标记金黄色葡萄球菌蛋白A（Protein A）：Protein A 可以与Ig G 的Fc 区特异性
的结合，因此Protein A 可以代替二抗：I125 标记的Protein A 通过放射性自显影检测。
金标记的二抗：二抗通过微小的金颗粒包裹，与一抗结合时可以表现红色。
生物素结合的二抗：印迹用生物素结合的二抗处理后，再用碱性磷酸酶或辣根过氧化物
酶标记的凝集素处理。生物素可以与凝集素紧密结合，这种方法实际上相当于通过生物素与
凝集素的紧密结合将二抗与酶连接，通过酶的显色反应就可以进行检测。这种方法的优点是
由于生物素是一个小分子蛋白，一个抗体上可以结合多个生物素，也就可以结合多个酶连接
的凝集素，可以大大增强显色反应的信号。
除了使用抗体或蛋白作为检测特定蛋白的探针以外，有时也使用其它探针如放射性标记
的DNA，可以检测印迹中的DNA 结合蛋白。