Western Blotting实验操作圻明生物培训资料二

 第二部分：样品的印迹

NC膜的预处理：
剪裁与胶大小一致的NC膜，将其浸入1×转移缓冲液平衡5 分钟以上。（注意：必须保证NC
膜始终*浸于转移缓冲液中）
PVDF 膜及滤纸的预处理：
剪裁与胶大小一致的膜泡入甲醇中，约1-2 分钟。
膜的选择：印迹中常用的固相材料有NC 膜、DBM、DDT、尼龙膜、PVDF 等。我们选用
PVDF（聚偏二氟乙烯），其具有更好的蛋白吸附、物理强度，以及具有更好的化学兼容性。
有两种规格：Immobilon-P（0.45um）和Immobilon-PSQ（0.2um for MW<20kDa）。
电流 1mA-2mA/cm2，我们通常200mA/膜，按照目的蛋白分子大小、胶浓度选择转移时间，
具体可以根据实际适当调整。

基本操作流程：
提取细胞或组织蛋白、测定大致含量
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制备SDS-PAGE胶
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蛋白样品变性、电泳
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电泳转膜
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封闭
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一抗

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TBST洗涤
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HRP标记的二抗
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TBST洗涤
↓
ECL试剂作用
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X-光片曝光、显影
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结果分析 

蛋白质印迹法首先是要将电泳后分离的蛋白质从凝胶中转移到硝酸纤维素膜上，通常有
两种方法：毛细管印迹法和电泳印迹法。毛细管印迹法是将凝胶放在缓冲液浸湿的滤纸上，
在凝胶上放一片硝酸纤维素膜，再在上面放一层滤纸等吸水物质并用重物压好，缓冲液就会
通过毛细作用流过凝胶。缓冲液通过凝胶时会将蛋白质带到硝酸纤维素膜上，硝酸纤维素膜
可以与蛋白质通过疏水相互作用产生不可逆的结合。这个过程持续过夜，就可以将凝胶中的
蛋白质转移到硝酸纤维素膜上。但这种方法转移的效率较低，通常只能转移凝胶中一小部分
蛋白质（10％～20％）。电泳印迹可以更快速有效的进行转移。这种方法是用有孔的塑料和
有机玻璃板将凝胶和硝酸纤维素膜夹成"三明治"形状，而后浸入两个平行电极中间的缓冲液
中进行电泳，选择适当的电泳方向就可以使蛋白质离开凝胶结合在硝酸纤维素膜上。