Elisa法检测细胞凋亡

这篇文章总结了Elisa法检测细胞凋亡实验原理、试剂配制、操作步骤，希望对大家有有帮助，有不当的地方，还望指正。

（一）  （一）实验原理
细胞凋亡的发生，是由于钙-镁依赖性核酸酶进入核小体间切割DNA,产生180bp～200bp或其倍数的核小体片段。而核小体由于与组蛋白H2A、H2B、H3和H4形成紧密复合物而不被核酸内切酶切割。采用双抗体夹心酶免疫法，应用小鼠抗DNA和抗组蛋白的单克隆抗体，与核小体片段形成夹心结构，可特异性检测细胞溶解物中的核小体片段。可通过检测核小体判断细胞是否经历凋亡事件。

（二）材料与试剂
1.选择Elisa试剂盒，生物标记的小鼠抗组蛋白单克隆抗体。
2.过氧化物酶（-POD）标记的小鼠抗DNA单克隆抗体
3.链霉亲合素包被的微孔板
4.DNA-组蛋白复合物，作为阴性对照。
5.ABTS底物
6.溶解缓冲液
7.温育缓冲液
8.底物缓冲液

（三）样品
1.培养细胞或离体细胞的裂解物细胞裂解步骤：收集细胞，离心后，用200µl溶细胞缓冲液重新悬浮，室温下作用30min。
2.培养细胞的上清液
3.血浆（血清）

（四）操作方法
1.取样品离心后（1 000r/min,10min）,吸取20µl上清液，加入链霉亲合素包被的培养板孔中。
2.另加入80µl免疫反应试剂含抗-DNA-POD、抗组蛋白-生物素及温育缓冲液（按1︰1︰18混合），室温下孵育2h（置摇床上，250r/min）。
3.取上清，用300µl温育缓冲液洗涤3次，小心移去洗涤液。
4.加入100µl底物缓冲液，室温下孵育使颜色变化至适合（置摇床上）。
5.尽快作比色分析（10min～20min内），用底物缓冲液作空白对照，以波长405nm，参考波长492nm进行检测。

（五）结果判定
按下列公式计算细胞释放的单/低聚核小体片段的特别聚集值：
注：mU=吸收值（10-3）=双孔吸收值的平均OD值-底物OD值，若样品的吸收值超过比色测定范围，应适当稀释后再检测。