ELISA方法测定血浆中C实验简介

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实验原理：
将抗C单克隆抗体包被固相聚苯乙烯板，加入经聚乙二醇（PEG）处理的待测样本，然后依次加入兔抗人C-IgC多克隆抗体和过氧化物酶标记的猪抗兔IsC，再加入底物2，2’-连氮-双（3-乙基苯骈唑啉-6-磺酸盐）（ABTS）和H2O2显色，于酶标仪405mn处测定每分钟光密度增加量（OD/min），以OD/min为纵坐标，C标准晶浓度为横坐标绘制标准曲线图，求出待测样本中C的含量。
实验试剂：
1. PBSPH7.2，9mmol/L磷酸盐缓冲液含140mmol/L NaCl。
2. PBS-Tween pH7.2 PBS含0.05％Tween20，简称PBS-T。
3. 底物溶液：100mL 2mmol/L ABTS溶液中含100mmol/L醋酸钠，50mmol/L磷酸钠，2.5mmol/L H2O2。
4. 沉淀剂：①：100mL pH8.0，20mmoL/L Tris-甘氨酸-HCl缓冲液中含20g PEG 4 000，0.8g Rivanol；沉淀剂②：100mLpH2.0.100mmol／L甘氨酸-HCl缓冲液中含20g PEG4000。
实验步骤：
1. 用盐和/或PEG沉淀血浆中C5：在微量反应板中加入EDTA抗凝血浆100gL，然后加人100/uL沉淀剂，用下述三种方法中任何一种沉淀血浆中C5。
   1） 在微量反应板中加入100uL 2mol/L HCl与100uL EDTA抗凝血浆混合，室温5h。加入HCl后血浆pH值在1.0-1.5之间。上清用4倍体积的0.29mol/L Tris调节至pH7.1-7.4。
   2） 在微量反应板中加入100uL沉淀剂①，室温30min。
   3） 在微量反应板中加入100uL沉淀剂②（血浆pH值在4.0-4.5之间）。室温30min。用方法2）和方法3）沉淀C5后，上清加入4倍体积的含0.05％Tween 20 pH7，10.21mol/L Tris-HCl缓冲液，血浆被稀释10倍。
2. 用抗C单克隆抗体（McAb）包被酶标反应板：用pHl0.6，50mmol/L碳酸钠溶液将抗CMcAb稀释成10ug/mL，每孔加100uL，4℃ 16h。次日取出每孔加含1％（W/V）明胶的PBSl50gL，室温lmin；然后用PBS-Tween 20洗涤一次。
3. 样本中CSa的检测：
洗涤后的酶标板，每孔加入方法1）、2）或3）处理的血浆样本zoot&，4℃16h，用PBS-Tween20洗涤1次，每孔加入用含0．1％明胶的PBS-T稀释的兔抗人CSa-IgC．多克隆抗体（46ug/mL）100t&，室温2h，用PBS-Tween20洗涤3次；每孔加入用含0.1％明胶PBS-T稀释的过氧化物酶标记的猪抗兔IgClOOt&（稀释前lmL过氧化物酶偶联物内加100ul无关鼠McAb、10ul人血浆或10ul激活的人血清处理），室温2min，每孔用PBS-Tween20洗涤4次；每孔加入底物溶液100ul，lmin后以PBS-T调零，每3min于酶标仪405nm处读取OD值。以OD/min增加量计算过氧化物酶活性。其活性与血浆中C含量呈正相关。本法zui低检测极限为1ng/mL，此法未检测出正常人新鲜血浆中的C。
4. 标准曲线的绘制：取已知浓度纯化的C，对倍稀释成一系列不同的浓度（0.039-5.000ng/mL），分别加入包被有抗CMcAb的酶标板中，然后按上述方法依次加入兔抗人C-IgC和过氧化物酶偶联的猪抗兔IgC及过氧化物酶的底物，以PBS-Tween调零点，读取OD40s/min增加量，以C（desarg）浓度为横坐标，OD40s/minx 200为纵坐标绘制标准曲线。每次绘制标准曲线应取6个已知浓度的纯化C。