纤维素酶活性测定方法

纤维素酶活性测定方法

    纤维素酶（β-1,4-葡聚糖-4-葡聚糖水解酶）是降解纤维素生成葡萄糖的一组酶的总称，它不是单体酶，而是起协同作用的多组分酶系，是一种复合酶，作用于纤维素以及从纤维素衍生出来的产物。
纤维素酶的组成与功能:
    纤维素酶根据其催化反应功能的不同可分为内切葡萄糖酶（1,4-β-D-glucan glucanohydrolase或endo-1,4-β-D-glucanase，EC3.2.1.4），来自真菌的简称EG，来自细菌的简称Cen、外切葡萄糖酶（1,4-β-D-glucan cellobilhydrolase或exo-1,4-β-D-glucannase，EC.3.2.1.91），来自真菌的简称CBH，来自细菌的简称Cex) 和β-葡聚糖苷酶（β-1,4- glucosidase，EC.3.2.1.21）简称BG。内切葡萄糖酶随机切割纤维素多糖链内部的无定型区，产生不同长度的寡糖和新链的末端。外切葡聚糖酶作用于这些还原性和非还原性的纤维素多糖链的末端，释放葡萄糖或纤维二糖。β-葡萄糖苷酶水解纤维二糖产生两分子的葡萄糖。真菌纤维素酶产量高、活性大，在畜牧业和饲料工作中主要应用真菌来源的纤维素酶。
纤维素酶活性测定（3,5-二硝基水杨酸法）
实验原理：

    纤维素酶水解纤维素，产生纤维二糖、葡萄糖等还原糖，能将3,5-二硝基水杨酸中硝基还原成橙黄色的氨基化合物，利用比色法测定其还原物生成量来表示酶的活力。
实验试剂：
1. 3,5-二硝基水杨酸显色液：称取10g 3,5-二硝基水杨酸，溶入蒸馏水中，加入20g分析纯氢氧化钠，200g酒石酸钾钠，加水500ml，升温溶解后，加入重蒸酚2g，无水亚硫酸钠0.5g。加热搅拌，待全溶后冷却，定容至1000ml。存于棕色瓶中，放置一周后使用。
2. 0.1摩尔pH4.5乙酸-乙酸钠缓冲溶液。
3. 0.5%羧甲基纤维素钠水溶液，溶解后成胶状液，静置夜过液（夜）。使用前摇匀。

4.标准葡萄糖溶液：称取干燥至恒重的葡萄糖100mg，溶解后定容至100ml，此溶液含葡萄糖1.00mg/ml。
5.酶液：将0.05g酶溶解定容至50ml，从中取出1ml再定容至100ml，待测。（用pH4.5乙酸-乙酸钠缓冲溶液配制）
实验器材：
1. 比色管10支。
2. 722型分光光度计。
3. 滴管。
4. 水浴锅。
5. 移液枪。
6. 电炉。
实验步骤：
1. 标准曲线的绘制：分别吸取0.2，0.4，0.6，0.8，1.0 ml的葡萄糖于5支比色管中，均用蒸馏水稀释至1ml，加3.5-二硝基水杨酸显色剂3ml，在沸水浴中煮沸显色10分钟，冷却，加蒸馏水21ml，摇匀。以1ml蒸馏水代替糖作空白管，在550nm处比色。以光密度为纵坐标，以葡萄糖微g数为横坐标，绘出标准曲线。
2. 空白管的测定:取1ml酶液，沸水浴5分钟，冷却加3ml0.5%CMC，与样品管同时放入50度水浴30分钟。其它操作同样品管。
3. 样品的测定：取0.5%羧甲基纤维素钠溶液3ml，酶液1ml，于50度水浴中糖化30分钟，取出，立即于沸水浴中煮沸10分钟使酶失活，得糖化液，冷却加入3ml显色液，再沸水浴10分钟，冷却后加水定容至25ml，混匀，550nm测OD值。
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