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DAPI染DNA的原理及使用方法(包含DAPI配制)

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2016/4/22 16:08:04

DAPI染DNA的原理及使用方法

DAPI 即4',6-二脒基-2-苯基吲哚(4',6-diamidino-2-phenylindole),分子式为C16H15N5·2C3H6O3 ,分子量457.48。

DAPI是一种能够与DNA强力结合的荧光染料。它结合到双链DNA小沟的AT碱基对处,一个DAPI分子可以占据三个碱基对的位置。结合到双链DNA上DAPI分子的荧光强度提高大约20倍,常用与荧光显微镜观测,根据荧光的强度可以确定DNA的量。另外,因为DAPI可以透过完整的细胞膜,它可以用于活细胞和固定细胞的染色。

在荧光显微镜观察下,DAPI染剂是利用紫外光波长的光线激发。单独DAPI的大吸收波长为340nm,大发射波长为488nm;当DAPI与双链DNA结合时,大吸收波长为364nm,大发射波长为454nm(10 mM Tris pH7.0,100 mM NaCl,10 mM EDTA),其发散光的波长范围含盖了蓝色青绿色。DAPI也可以和RNA结合,但产生的荧光强度只有与DNA结合的荧光强度的1/5,其发散光的波长范围约在500nm左右。

DAPI的配制及贮存

固体粉末:避光,2-8 ℃保存,3年没有问题。

贮存液:用无菌水配制成浓度1 mg/ml的贮存液,配好后用锡纸包起来,避光,可在-20 ℃下长期保存。(DAPI易溶于水,在PBS中溶解度不高)

使用浓度:贮存液用1xPBS稀释到终浓度100 ng/ml。

荧光封片液:0.5 mol/L碳酸盐缓冲液与甘油等体积混合,pH9.5

染色与观察:制好的玻片上滴加几滴DAPI染液,染色10分钟,流水冲去染液,滤纸吸除多余水分,加一滴荧光封片液,置于荧光显微镜下观察,激发波长360-400nm。

注意事项:DAPI可能具有致癌性,全部操作过程中必须带塑料或乳胶手套。

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