技术文章

个别组织细胞的培养

体内组织细胞在体外培养时，所需培养环境基本相似，但由于物种、个体遗传背景及所处发育阶段等的不同，各自要求条件有一定差别，所采取的培养技术措施亦不尽相同，现介绍个别组织细胞培养的要点如下:
一、上皮细胞培养
    上皮细胞包括腺上皮是很多器官如肝、胰、乳腺等的功能成分，又由于癌起源于上皮组织，故上皮细胞培养特别受到重视。但上皮细胞培养中常混杂有成纤维细胞，培养时生长速度往往超过上皮细胞，并难以纯化，同时上皮细胞难以在体外长期生存，因此纯化和延长生存时间是培养关键。
    体内上皮细胞生长在胶原构成的基膜，因此培养在有胶原的底物上可能利于生长，另外人或小鼠表皮细胞培养在以3T3细胞为饲养层（用射线照射后）时，细胞易生长并可发生一定程度的分化现象。降低PH、Ca2+含量和温度，向培养基中加入表皮生长因子，均有利于表皮细胞生长。
    以表皮细胞为例，用皮肤表皮和分离培养法可获得纯上皮细胞，其法如下（黑木凳志夫  1981）
    1、取材：外科植皮或手术残余皮肤小块，早产看产儿皮肤更好，取角化层薄者，切成0.5－1平方厘米小块。
2、置0.02%EDTA中，室温，5分钟。
    3、换入0.25%胰蛋白酶中，4℃置夜。
    4、分离：取出皮块，用血管钳或镊子将表皮与层分开。
    5、取出表皮，剪成更小的块后，置0.25%胰酶中，37℃，30—60分钟。
    6、反复吹打，制成悬液。
    7、培养：用80目不锈钢纱网滤过后，低速离心，吸去上清。
    8、直接加入培养基（Eagle加20%小牛血清）制成细胞悬液，接种入培养瓶，CO₂温箱培养。
    二、内皮细胞培养
 内皮细胞易于从大血管分离培养成单层细胞，对于研究内皮细胞再生、肿瘤促血管生长因子（TAF）等有很大价值。
  研究人内皮细胞培养以人脐带静脉灌流消化法zui为简便，其法如下：
1、产后新鲜脐带，无菌剪取10—15厘米长一段，如不能立即培养，可于12小时内保存于4℃。
2、用三通注射器吸取温PBS液注入脐静脉中洗去残血，在入口处用线绳扎紧，以防液体返流。
3、用血管钳夹紧脐带一端，从另一端向脐静脉中徐徐注入终浓度为0.1%的粗制胶原酶，充满血管，消化3—10分钟；注入口用线绳扎，以防液体返流。
4、吸出含有内皮细胞的消化液，于离心管中，注入温PBS轻轻反复冲洗后，一并注入离心管中（此步骤可重复）。5、离心去上清，加入RPMI1640培养液制成细胞悬液，接种入培养器皿中，置温箱培养。两至三天可见细胞长成单层。
三、神经胶质细胞培养
    神经细胞（神经元）不易培养，只有在适宜情况下，如接种在胶原底层上，或加入神经生长因子和胶质细胞因子时，可出现一定程度的分化，长出突起等现象

，但很难使之增值。而神经胶质细胞是神经

组织中比较容易培养的成分。
  人、鼠等脑组织即可用于神经胶质细胞培养，不仅能获得生长的胶质细胞，也可形成能传代的二倍体细胞系。一般说来，胶质细胞在培养中生长不稳定，不易自发转化，但对外界因素仍保持很好的敏感性，可用ROUS病毒和SV₄等诱发转化。
养方法如下：
1、从手术室无菌取脑髓灰质或白质后，仔细剥除脑膜、血管和纤维成分，置Hanks液中漂洗一、二次。
2、置于30—50倍体积的Hanks液中，此时脑组织比较柔软，反复吹打即制成细胞悬液。
3、把悬液注入离心管室温中直立5—10分钟后，细胞或细胞团快自然下沉，脂肪等杂物易漂浮，可吸除上层、反复二、三次，即可排除脂肪成分和其它碎块并获较多细胞成分。
4、在沉降物中加入适量培养液，通过纱网成纱布过滤，计数并调整细胞密度。  
5、接入培养瓶或皿中，置5%CO₂温箱中培养。
该细胞适应环境过程较长，接种后贴壁较慢。贴壁后短期内也可能不见细胞分开现象，然而一旦生长后即能迅速进入旺盛的增殖状态。细胞传代可以0.25%胰酶消化处理。