线粒体膜电位检测试剂盒（JC-1）/BestBio-贝博生物

使用方法：

    使用注意事项：

• 螺旋盖微量试剂管装的试剂在开盖前请短暂离心，将盖内壁上的液体收集至管底，避免开盖时液体洒落。
• JC-1在温度较低时会凝固，可以20～25℃水浴温育片刻全部融解后离心使用。
• 细胞处理需要小心操作,尽量避免人为的损伤细胞。
• 配制染色工作液时，JC-1容易形成聚集体，所以需要边振荡边加。若仍有不溶的颗粒，可在13000 ×g离心1分钟，吸取离心后的上清使用。
• 始终保持平衡染液中pH值的*性，因为pH值的变化将影响膜电位。
• 与染料达到平衡的细胞悬液中如果含有蛋白，他们将与部分染料结合，降低染料的浓度，引起假去极化。
• 根椐细胞种类、实验条件不同流式细胞仪设置不同。
• JC-1液产生沉淀离心取上清使用即可，不影响结果。
• JC-1染色并洗涤后尽量在30分钟内完成后续检测。在检测前需冰浴保存。

悬浮细胞

1、孵育缓冲液和JC-1染色工作液的配制：根据样品数按下列比例配制孵育缓冲液和JC-1染色工作液。取100ul 10×孵育缓冲液加900ul无菌纯水稀释，混匀并预热至37℃，即成1×孵育缓冲液；在500ul 1×孵育缓冲液中加入5ul JC-1，涡旋混匀配成JC-1染色工作液；

2、收集样本细胞以及阴性、阳性对照细胞。细胞数量在2-5X10⁵个。

3、用PBS洗涤细胞两次。离心收集细胞。

4、用500ul JC-1染色工作液将细胞重悬，37℃，5% CO2的培养箱中孵育15分钟。

5、常温离心收集细胞。

6、用500ul预热的孵育缓冲液将细胞重悬。

7、用流式细胞仪或荧光分光光度计检测分析结果，或者用荧光显微镜或激光共聚焦显微镜观察结果。

贴壁细胞

对于贴壁细胞，可以先收集细胞，重悬后参考悬浮细胞的检测方法。

纯化线粒体

1、把配制好的JC-1 染色工作液再用JC-1孵育缓冲液(1×)稀释5 倍。

2、0.9mL 5倍稀释的JC-1 染色工作液中加入0.1mL 总蛋白量为10～100ug的纯化的线粒体。

3、结果检测。

组织样本

组织样本可以用玻璃匀浆器匀浆成单细胞悬液后按照细胞样本的方法检测。也可以用其他细胞悬液制备的试剂盒处理组织后检测。

线粒体膜电位检测试剂盒（JC-1）/BestBio-贝博生物

结果分析 ：

检测JC-1单体时可以把激发光设置为490nm，发射光设置为530nm；检测JC-1聚合物时，可以把激发光设置为525nm，发射光设置为590nm。

用流式细胞仪检测细胞凋亡的情况，绿色荧光通过FL1通道检测；红色荧光通过FL2通道检测。FL-1+,FL-2+为正常细胞，FL-1+,FL-2—为凋亡细胞。

用荧光显微镜或激光共聚焦显微镜观察：检测JC-1单体时可以参考观察其它绿色荧光时的设置，如观察GFP或FITC时的设置；检测JC-1聚合物时可以参考观察其它红色荧光，如PI或Cy3时的设置。出现绿色荧光说明线粒体膜电位下降，并且该细胞很可能处于细胞凋亡早期。出现红色荧光说明线粒体膜电位比较正常，细胞的状态也比较正常。

用荧光分光光度计或荧光酶标仪检测：激发波长为485nm，发射波长为590nm。如果使用荧光酶标仪，激发波长不能设置为485nm 时，可以在475～520nm 范围内设置激发波长。

参考文献：

• Gang Wang, JunJie Wang, Jie Luo et al.        

PEG2000-DPSE-coated quercetin nanoparticles remarkably enhanced anticancer effects through induced programed cell death on C6 glioma cells

Journal of Biomedical Materials Research     2013       （IF=2.625）

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