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10912ES10 多片段一步法快速克隆试剂盒
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企业简介
翌圣生物科技（上海）股份有限公司【Yeasen Biotechnology (Shanghai) Co., Ltd.】是一家以蛋白质改造和酶进化技术为驱动，聚焦生命科学产业链上游核心原料，从事分子、蛋白和细胞三大品类生物试剂的研发、生产与销售的高新技术企业，通过打通分子酶、蛋白、抗体、核酸、细胞的技术开发路径，成为国内少数同时覆盖三大品类生物试剂、兼备核心技术自主研发能力和规模化生产能力的高新技术企业，产品广泛应用于生命科学研究领域、诊断与检测领域和生物医药领域。
主营业务
公司凭借在蛋白质改造和酶进化领域的技术优势和深耕生物试剂行业多年积累的丰富经验，构建了品质优良、类型齐全、种类丰富的产品管线。自公司成立以来，公司研发、生产和销售的生物试剂超过3000种，涵盖分子、蛋白、细胞三大品类的生物试剂，能够满足客户多种类型生物试剂的一体化采购需求。公司核心产品覆盖qPCR系列、NGS系列、逆转录系列、核酸提取与纯化系列、PCR系列、分子克隆系列、体外转录系列、抗体、蛋白纯化系列、蛋白分析系列、重组蛋白、细胞分析系列、细胞培养系列、细胞转染系列、报告基因检测系列等多个品类的生物试剂，广泛应用于生命科学研究、诊断检测和生物医药等领域。
发展历程
荣誉资质
翌圣生物通过申请商标和软件著作权的方式保障核心技术和市场竞争力，不断加强公司品牌建设。截至2022年3月31日，公司已经获得授权18项（其中发明14项、实用新型1项、外观设计3项）和45项与生物试剂相关的软件著作权，拥有经国家知识产权局商标局核准的注册商标权37项以及4项境外注册商标，是国家高新技术企业和上海市专精特新企业。
创新平台
经过多年的产品研发技术经验的沉淀以及持续的研发创新，翌圣生物积极开展“产学研”合作，与拥有生物催化与酶领域国家重点实验室的湖北大学、拥有教育部工业生物领域重点研究基地的江南大学展开合作，优化生物试剂关键原料的生产和表达工艺。翌圣生物以基因工程技术、生物信息技术、细胞生物学技术、免疫学技术、生化分析技术等生命科学领域的共性生物技术为基础，建立了六大核心技术平台——双向分子酶理性设计与定向进化平台、密度发酵与超洁净纯化平台、分子诊断试剂关键原料研发平台、高通量测序建库试剂创新研发平台、高性能单克隆抗体研发平台和mRNA医药应用研发平台，目前已经自主研发出20项核心技术，打通分子酶、蛋白、抗体、核酸、细胞的技术开发路径，覆盖技术研发、产品升级、规模生产和质量控制等生物试剂研发和生产的各关键环节。
工业化生产
翌圣生物拥有按照准GMP 标准建设运营的工业化生产基地，配有吨级发酵线、工业级 AKTA 纯化线和全自动包装线。同时，公司通过了ISO 13485:2016质量管理体系认证，从原料控制、生产管理、质检管控、仓储运输等对生产线进行360度管理监督，保证产品过程的可控制性及可追溯性，竭尽全力为您提供可靠的产品。
客户服务
翌圣生物凭借优质稳定的产品质量、高效及时的响应能力、快速稳定的交付能力和周到完备的售后服务获得了众多科研用户和工业用户的认可，为检测公司、治疗公司、工具类公司和科学研究实验室提供应用于科学研究、体外诊断、基因测序、生物医药等的生物试剂。与中国科学院、清华大学、北京大学、复旦大学、上海交通大学、浙江大学等顶尖科研院所和华大基因、恒瑞医药、药明康德、之江生物、圣湘生物、斯微生物、金斯瑞、思路迪等工业客户建立了稳定、紧密的合作关系，公司产品被多次使用在Nature、Science、Cell等国际顶级期刊论文发表中。
公司企业文化
帮助客户创造价值，让世界更健康更快乐
◎ 成为生命科学工具领域全球Top⑩
◎ 具备驱动产业变革的技术创新能力
◎ 拥有一支持续学习型的翌圣铁军
翌圣生物始终秉承“帮助客户创造价值，让世界更健康更快乐”的使命，专注于技术创新和产品升级，不断拓展核心技术的应用领域，为客户提供更为的产品与服务，助力我国打造自主可控的生物试剂产业链。同时，翌圣生物将进一步推进国际化战略，继续布局和拓展海外市场，为全球生物试剂产业发展贡献力量。
详细信息
产品信息
产品名称 | 货号 | 规格 | 储存 | 价格（元） | *（元） |
Hieff Clone® Plus Multi One Step Cloning Kit 多片段一步法快速克隆试剂盒 | 10912ES10 | 10 T | -20℃ | 457.00 |
Hieff Clone® Plus Multi One Step Cloning Kit是一款简便、快速、高效的DNA定向克隆产品，该试剂盒可以将PCR产物定向克隆至任何载体的任何位点，可高效克隆50 bp-10 kb片段。将载体线性化，并在插入片段正、反向PCR引物5’端引入15-25 bp的线性化载体末端同源序列，使得插入片段PCR产物5’和3’末端分别带有与线性化载体两末端对应的*一致的序列。PCR产物和线性化载体在重组酶的作用下，仅需50℃反应20 min即可进行转化，完成定向克隆。克隆阳性率可达95%以上。
试剂盒中2×Hieff Clone® MultiS Enzyme Premix预混了重组酶和重组反应所需缓冲液，并添加了*的重组增强因子，可显著提高重组克隆效率。使用该试剂盒，可以一次实现多至5个片段的顺序拼接克隆。
产品组分
编号 | 组分 | 10912ES10 (10 T) |
10912-A | 2× Hieff Clone® MultiS Enzyme Premix | 100 μL |
10912-B | 500 bp Control Insert (25 ng/μL) | 5 μL |
10912-C | pUC 19 Control Vector, linearized (50 ng/μL) | 5 μL |
快速克隆；定向克隆；定点突变。
运输与保存方法
冰袋运输。-20℃保存，有效期1年。
注意事项
1）为了您的安全和健康，请穿实验服并佩戴一次性手套操作。
2）本产品仅作科研用途！
实验流程
① 载体线性化：酶切或反向PCR制备线性化载体。
② 插入片段的制备：由PCR制备，所用扩增引物在设计时需在其5’端添加同源序列（图中以红色、黄色、紫色和绿色标记)，使得扩增产物之间以及扩增产物与线性化载体之间各有一段同源序列。
一. 制备线性化载体
选择合适的克隆位点，并对载体进行线性化。建议尽量选择无重复序列且GC含量均匀的区域进行克隆。载体克隆位点上下游25 bp区域内GC含量均在40%-60%范围内最佳。线性化载体可通过限制性内切酶酶切或反向PCR扩增获得。
1.酶切制备线性化载体
1）双酶切线性化：线性化*，转化背景低。建议使用。
2）单酶切线性化：线性化程度较差。可适当延长酶切时间以降低转化背景。
【注】：不含插入片段的假阳性克隆是由未线性化环状载体转化而形成的。若这种假阳性克隆比例较高，建议重新制备线性化载体。
2.反向PCR扩增制备线性化载体
建议使用高保真聚合酶（如：Hieff Canace® High-Fidelity DNA Polymerase，Cat No. 10135ES）进行载体扩增，以减少扩增突变的引入。PCR扩增模板应尽量使用预线性化质粒，以防止残留环状质粒模板对克隆阳性率的影响。
Hieff Clone®重组反应体系兼容几乎所有酶切反应体系和常规PCR反应体系，当载体酶切产物或反向PCR扩增产物纯度较高时，可以无需纯化，直接进行重组反应。但纯度较低且有可能含有未线性化环状质粒时，建议使用高质量的试剂盒对线性化载体进行胶回收纯化，以提高产物纯度并去除一部分未线性化的环状载体，有利于提高重组效率。
二. PCR扩增制备插入片段
1.设计扩增引物
Hieff Clone® 引物设计方式：通过在插入片段正、反向PCR引物的5’端引入15-25 bp（不包括酶切位点）的线性化载体末端同源序列，使得插入片段PCR产物5’和3’末端分别带有与线性化载体两末端对应的*一致的序列。
推荐使用翌圣无缝克隆引物设计软件（122.112.245.84:8080/hieff-clone/），自动生成插入片段的扩增引物。若手动设计，可参照以下实例。以在pUC18载体（注：与该试剂盒中提供的C组分不同，C组分为pUC19）的EcoR I 和Hind III 酶切位点间插入三段基因的引物设计为例，引物具体设计方案如下：
首先设计第一片段的正向扩增引物和第三片段的反向扩增引物(与载体相邻的两个插入片段)。
第一片段正向扩增引物设计方式：
5’—上游载体末端同源序列+酶切位点（可保留或删除）+第一片段基因特异性正向扩增序列—3’
第三片段反向扩增引物设计方式：
3’—第三片段基因特异性反向扩增序列+酶切位点（可保留或删除）+下游载体末端同源序列—5’
【注】：
① 基因特异性正/反向扩增序列即常规插入片段正/反向扩增引物序列；
② 上游/下游载体末端同源序列为线性化载体最末端序列（用于同源重组），GC含量40%-60%为佳。
其次设计第一片段的反向扩增引物和第二片段的正向扩增引物。用于片段之间进行重组的同源序列可以添加至前方片段的反向扩增引物中，也可以添加至后方片段的正向扩增引物中，还可以两片段各添加一部分。以将同源序列添加至前方片段 （第一片段）的反向扩增引物中为例，引物具体设计方案如图3所示：
第一片段反向扩增引物设计方式：
3’—第一片段基因特异性反向扩增序列+第二片段5’端同源序列—5’
第二片段正向扩增引物设计方式：
5’—第二片段基因特异性正向扩增序列—3’
【注】：
① 基因特异性正/反向扩增序列即常规插入片段正/反向扩增引物序列；
② 第二片段5’端同源序列即用于第一片段与第二片段进行重组的添加序列。
最后设计第二片段的反向扩增引物和第三片段的正向扩增引物。设计方式与第一片段的反向扩增引物和第二片段的正向扩增引物设计方式一致。 
【注】：最终引物长度超过40 bp，建议选用PAGE纯化方式进行引物合成。计算扩增引物退火温度时，只需计算基因特异性扩增序列的Tm值，载体末端同源序列不应参与计算，为了得到高效率克隆，建议Tm≥48℃。
2.插入片段PCR扩增
插入片段扩增可用任意PCR酶扩增，无需考虑产物末端有无A尾 (重组过程中将被去除，在最终载体中不会出现)。但为了减少扩增突变的引入，建议使用高保真聚合酶进行扩增（Hieff Canace® High-Fidelity DNA Polymerase，Cat No. 10135ES）。
PCR扩增结束后，取少量产物进行琼脂糖凝胶电泳以检验扩增产量和特异性。Hieff Clone®重组反应体系兼容常规PCR反应体系。因此，如果扩增模板不是与载体抗性相同的环状质粒，且PCR产物电泳条带单一，则扩增产物可以无需纯化，直接用于重组反应。但PCR扩增产物纯度较低时，建议使用高质量的试剂盒对PCR扩增产物进行胶回收纯化，以提高产物纯度，有利于提高重组效率。
三. 线性化载体与插入片段浓度测定
推荐使用琼脂糖凝胶电泳比较条带亮度的方法对DNA进行定量。将线性化载体和插入片段扩增产物做数个等体积稀释梯度，原始产物和稀释后产物各取1 μL进行琼脂糖凝胶电泳，与DNA分子量标准（DNA Marker）比较条带亮度以确定其近似浓度。
四. 重组反应
1. 线性化载体与插入片段使用量计算
Hieff Clone® Plus Multi重组反应体系最适DNA使用量为每片段（包括线性化载体）0.03 pmoL。该摩尔数对应的DNA质量可由以下公式粗略计算获得：
每片段最适使用量= [0.02×载体碱基对数]ng (0.03 pmoL)
例如，将长度为0.5kb、1kb、2 kb三插入片段克隆至长度为5 kb的载体时，各片段最适使用量应为：
线性化载体最适使用量：0.02 × 5000 = 100 ng；
0.5kb插入片段最适使用量应为：0.02 × 500 = 10 ng；
1 kb插入片段最适使用量应为：0.02 × 1000 = 20 ng；
2 kb插入片段最适使用量应为：0.02 × 2000 = 40 ng。
【注】：
1）插入片段DNA使用量应大于10 ng。当使用上述公式计算DNA最适使用量低于这个值时，直接使用10 ng即可。
2）线性化载体的使用量应在50-200 ng之间。当使用上述公式计算最适使用量超出这个范围时，则选择低或高使用量即可。
3）线性化载体和插入片段扩增产物未纯化，直接使用时，使用总体积应不超过反应体系体积的1/5，如20 μL体系不超过4 μL。
2.反应体系（推荐冰上配制，各组分使用前需混匀）
组分 | 重组反应 | 阴性对照-1 | 阴性对照-2 | 阳性对照 |
ddH2O | Up to 20 μL | Up to 20 μL | Up to 20 μL | Up to 20 μL |
2× Hieff Clone® MultiS Enzyme Premix | 10 μL | 0 μL | 0 μL | 10 μL |
线性化载体 | X μL | X μL | 0 μL | 1 μL |
N个插入片段 | Y μL | 0 μL | Y μL | 1 μL |
【注】：
1）X和Y分别是根据公式计算得到线性化载体和插入片段用量。
2）阴性对照-1可用来确认线性化载体有无环状质粒残留，可选择性进行。
3）当插入片段扩增模板是与载体抗性相同的环状质粒时，可用阴性对照-2来确认有无环状质粒模板残留，可选择性进行。
4）试剂盒中提供阳性对照反应所需组分（B组分和C组分），可用来排除其他实验材料及操作因素的影响，可选择性进行。
3.重组反应
1）体系配制完成后，用移液器轻轻吸打混匀各组分，短暂离心将反应液收集至管底。
2）置于50℃反应20 -50 min。当插入片段总和＞5 kb时，建议提高孵育时间到30-50 min可以增大重组效率。
注：建议在PCR仪或水浴锅等温控精确的仪器上进行反应。
3）待反应完成后，建议将反应管置于冰上冷却5 min，以防温度过高降低感受态转化效率。
4）反应产物可直接进行转化，也可储存于-20℃，待需要时解冻转化。
五. 重组产物转化、涂板
1）在冰上解冻克隆感受态细胞（如：DH5α Chemically Competent Cell，Cat No. 11802ES）。
2）取10 μL冷却重组产物，加入到100 μL感受态细胞中，轻弹管壁数下混匀，在冰上放置30 min。
3）42℃热激90秒，冰浴孵育2 min。
4）加入900 μL SOC或LB培养基，37℃孵育10 min充分复苏。37℃，200 rpm，摇菌45 min。
5）5000 rpm离心3 min，弃掉900 μL上清。用剩余培养基将菌体重悬，用无菌涂布棒在含有正确抗性的平板上轻轻涂匀。待菌液被吸收，将平板倒置，于37℃过夜培养。
六. 克隆鉴定
方便快捷的方法是菌落PCR。用无菌的枪头或牙签将单个菌落挑至20-50 μL LB培养基中混匀，直接取1 μL作为PCR模板。推荐至少用一条通用测序引物进行菌落PCR，这样可以避免PCR假阳性的产生。后续也可做酶切或测序鉴定。
应用实例
图4. Hieff Clone® Plus Multi One Step Cloning Kit进行三片段克隆。
A：重组转化平板。B：插入片段和载体浓度检测电泳图。C：PCR方法鉴定每个单片段和最终连接基因。箭头指示目的条带。载体：pCAMIBA1302，10 kb，三个插入片段长度：1 kb，1.5 kb和2.5 kb，重组反应条件：50℃，20 min。
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