iElisa 呕吐毒素检测试剂盒

iElisa 呕吐毒素检测试剂盒

1. 概要 呕吐毒素也称为脱氧雪腐镰刀菌烯醇（DON）， 是由串珠镰刀菌、轮状镰刀菌以及多育镰刀菌等产 生的真菌毒素，大多存在于粮谷、饲料及其制品中。 中毒后影响消化系统和神经系统，主要表现为恶 心、呕吐、头痛、头晕、腹痛、腹泻等症状。我国 标准规定：玉米、大麦、小麦及其制品中呕吐毒素 不得超过 1mg/kg，猪、犊牛、泌乳期动物配合饲料 中呕吐毒素不得超过 1mg/kg，牛、家禽配合饲料中 呕吐毒素不得超过 5mg/kg。 2. 原理 测定的基础是抗原-抗体反应。微孔板上包被有 抗抗体。加入呕吐毒素（DON）标准品或样品、酶 标抗原和抗体后，游离的呕吐毒素与酶标抗原竞争 结合抗体，抗体或抗体结合物与固定在微孔板上的 抗抗体再结合，没有结合的标准品、酶标抗原及抗 体被洗去，加入 TMB 底物显蓝色，加入终止液后 颜色由蓝变黄，用酶标仪在 450nm 处检测，吸光值 与样品中呕吐毒素含量成负相关，与标准曲线比较 即可得出呕吐毒素的含量。 3. 试剂盒的组成 1) 包被有抗抗体的96微孔板：1块（96 孔，12 条 ×8 孔） 1) 呕吐毒素标准品：0 ng/ml 、10ng/ml、 20ng/ml、50ng/ml、200ng/ml 1 瓶 × 1.0ml 2) DON抗体： 1 瓶 × 10ml 3) DON酶标抗原： 1 瓶 × 10ml 4) 10× 浓缩洗涤液： 1 瓶 × 50ml 5) DON稀释缓冲液A： 1 瓶 ×50ml 6) DON稀释缓冲液B： 1 瓶 ×50ml 7) 显色底物TMB： 1 瓶 ×17ml 8) 终止液： 1 瓶 × 7ml 9) 试剂盒说明书： 1 份 10) 质检报告： 1 份 4. 需要的仪器、试剂 1） 仪器 —酶标仪 450nm（iElisa 全自动酶标仪或相当者） —微量移液器：20μl-200μl 单道，100μl-1000μl 单道, 50μl-300μl 八道 —多功能旋转混合器（或者摇床、高速均质器） —酶标板振荡器 —涡旋混合器 —离心机 —50ml 离心管 —1.5ml 离心管 —定性滤纸 —过滤漏斗 —天平：感量 0.01g 2） 试剂 —纯水（蒸馏水、去离子水） 5. 样品处理 5.1 谷物（玉米、小麦、大麦、大米、大豆）： 1） 称取 5.0g 粉碎样品于 50ml 离心管中，加入 25.0ml 样品提取液纯水,置于多功能旋转混合 器上振荡 10 分钟（或使用高速均质器均质 3 分钟，或摇床上振荡 40 分钟），3000 转/分离 心 5min。 2） 将上层提取液用普通滤纸过滤，吸取 100μl 滤 液置于 1.5ml 离心管中，加入 400μl DON 稀释 缓冲液 A，用涡旋混合器混匀。 稀释倍数：25 5.2 饲料： 1) 称取 5.0g 粉碎样品于 50ml 离心管中，加入 25.0ml 样品提取液纯水,置于多功能旋转混合 器上振荡 10 分钟（或使用高速均质器均质 3 分钟，或摇床上振荡 40 分钟），3000 转/分离 心 5min。 2) 将上层提取液用普通滤纸过滤，测 pH 值，如 果不在 pH6-8 范围内，请用酸或碱进行调整。 3) 吸取 50μl 滤液置于 1.5ml 离心管中，加入 450ul DON 稀释缓冲液 B，用涡旋混合器混匀。 稀释倍数：50 5.3 发酵液： 吸取 40μl 液体样品置于 1.5ml 离心管中，加入 960μl DON 稀释缓冲液 B，用涡旋混合器混匀。 稀释倍数：255.4 尿液样品： 1) 取 5ml 待检样品于 15ml 离心管中，3000r/min， 离心 10 分钟 2) 吸取 100μl 离心后澄清样品置于 1.5ml 离心管 中 3) 加入 400μl DON 稀释缓冲液 A，用涡旋混合器 混匀。 稀释倍数：5 6． 酶联免疫分析程序 6.1 测定之前注意事项 1) 使用前将所有试剂平衡至室温（20-25℃）。 2) 使用后迅速将试剂放入 2-8℃冷藏。 3) 在 ELISA 分析中的再现性，很大程度上取决于 洗板的*性，正确的洗板操作是 ELISA 测定 程序中的要点。 4) 所有温育过程应避免阳光直射，并按要求用盖 板覆盖住酶标板。 6.2 溶液的配制 1) 提取液的配制:纯水（或蒸馏水、去离子水）。 2) 洗涤液的配制：将浓缩洗涤液用纯水稀释 10 倍后使用。（例如：取 10 ml 浓缩液+90 ml 纯 水, 可以用于 32 孔的检测）。 6.3 测定程序 1) 将足够标准品和样品所用数量的孔条插入酶 标板架，标准品和样品做两个平行实验，记录 下标准和样品的位置。未使用的酶标板用铝箔 袋封好置 2-8℃冷藏保存。 2) 吸取 50μl 标准品或样品分别加至相应的微孔 （双孔）中，然后各加入 50μl 的 DON 酶标抗 原、50μl 的 DON 抗体，加盖，在 37℃温育 30 分钟（每个标准品和样品必须使用新的吸头）。 3) 倒出孔中的液体，每孔加入 250μl 稀释好的洗 涤液，置于酶标板振荡器上振荡 30 秒钟（或 者手工振荡），重复操作四次。洗完后用力在 吸水纸上拍干。 4) 每孔加入150μl底物，37℃避光温育10分钟。 5) 每孔加入50μl 终止液。 6) 置于酶标仪中，振荡混匀，在450nm处测定吸 光度值（OD值），参比波长630nm。（iElisa全 自动酶标仪可以直接读出、打印浓度值）。 7. 结果判定 1) 所获得的每个浓度标准溶液和样本吸光度值 的平均值（B）除以*个标准（0 标准）的吸 光度值（B0）再乘以 100%，即百分吸光度值。 百分吸光度值（%）＝ B ×100% B0 以呕吐毒素标准品浓度值（ppb）为 X 轴，百 分吸光度值为 Y 轴，绘制标准曲线图。相对应每一 个样品的浓度可以从标准曲线上读出。也可以用回 归方程法，计算出样本溶液浓度。利用计算机专业 软件，更便于大量样品的快速分析。 2） 样品的实际浓度为读数结果乘以相应的稀释倍 数。 3） 如果测定值超出检测范围，样品提取溶液按一 定的比例用纯水进行稀释。 8. 注意事项 1) 室温低于20℃或试剂及样品未回到室温（20- 25℃）会导致数值偏低。 2) 在洗板过程中如果出现板孔干燥过久的情况， 则会出现标准曲线不成线性，重复性不好的现 象。所以洗板排干后应立即进行下一步操作。 3) 标准物质和显色液对光敏感，避免直接暴露在 光线下。 4) 混合要均匀，洗板要*（包括加样品和标准 液的时候都必需充分混合均匀）。 5) 终止液为强酸性物质，避免接触皮肤。 6) 不要使用过了有效期的试剂盒，也不要混合使 用不同批次的试剂盒，这样会引起测定结果不 准确。 7) 试剂盒的储存条件是2-8℃，切勿冷冻。 9. 试剂盒的性能指标 1) 检测限 LOD: 谷物 0.15ppm（mg/kg），饲料 0.25ppm（mg/kg），发酵液 0.15ppm（mg/kg）, 尿液 0.05ppm（mg/kg）。（LOD：空白样品测定 值+2 倍标准偏差 SD） 2) 定量限 LOQ: 谷物 0.25ppm（mg/kg），饲料 0.5ppm（mg/kg），发酵液 0.25ppm（mg/kg）, 尿液 0.1ppm（mg/kg）。 3) 定 量 检 测 范 围 ： 谷 物 0.25-5.0ppm ，饲料 0.5-10.0ppm ， 发 酵 液 0.25-5.0ppm, 尿 液 0.1-1.0ppm。