iElisa 三聚氰胺检测试剂盒

iElisa 三聚氰胺检测试剂盒

1. 概要 三聚氰胺是一种化工原料，在食品和饲料中不 得人为添加，长期摄入会造成生殖、泌尿系统的损 害，膀胱、肾部结石，并可进一步诱发膀胱癌。中 国卫生部等 5 部委 2011 年第 10 号公告中规定婴儿 配方食品中三聚氰胺的*值为 1mg/kg，其他食品 中三聚氰胺的*值为 2.5mg/kg，高于上述*的 食品一律不得销售。 2. 原理 测定的基础是抗原-抗体反应。微孔板上包被有 三聚氰胺包被原。加入三聚氰胺（MEL）标准品或 样品、和抗体后，游离的三聚氰胺与包被原竞争结 合抗体，没有结合的抗体及抗原被洗去，再加入酶 标二抗，与抗体-包被原的结合物反应，再次洗板后， 将未结合的酶标二抗洗去。加入 TMB 底物显蓝色， 加入终止液后颜色由蓝变黄，用酶标仪在 450nm 处 检测，吸光值与样品中三聚氰胺的含量成负相关， 与标准曲线比较即可得出三聚氰胺的含量。 3. 试剂盒的组成 1) 包被有包被原的96微孔板：1块（96 孔，12 条 ×8 孔） 2) 三聚氰胺标准品：0 ng/ml、2.0ng/ml、 5.0ng/ml、15ng/ml、50ng/ml、150 ng/ml、 450ng/ml； 1 瓶 × 1.0ml 3) MEL抗体： 1 瓶 × 10ml 4) 酶标二抗： 1 瓶 × 10ml 5) 10× 浓缩洗涤液： 1 瓶 × 50ml 6) 复溶液 1 瓶 × 50ml 7) MEL稀释缓冲液A： 1 瓶 ×50ml 8) MEL稀释缓冲液B： 1 瓶 ×50ml 9) 显色底物TMB： 1 瓶 ×17ml 10) 终止液： 1 瓶 × 7ml 11) 试剂盒说明书： 1 份 12) 质检报告： 1 份 4. 需要的仪器、试剂 1）仪器 —酶标仪 450nm（iElisa 全自动酶标仪或相当者） —微量移液器：20μl-200μl 单道，100μl-1000μl 单道, 50μl-300μl 八道 —多功能旋转混合器（或者摇床、高速均质器） —酶标板振荡器 —涡旋混合器 —50ml 离心管 —1.5ml 离心管 —定性滤纸 —过滤漏斗 —天平：感量 0.01g 2） 试剂 —乙腈、正己烷、氢氧化钠 —纯水（蒸馏水、去离子水） 5. 样品处理 样品处理前的准备： （1）1mol/L NaOH 溶液的配制： 称取 4.0g NaOH 加纯水溶解并定容至 100ml。 （2）0.1 mol/L NaOH 溶液的配制： 称取 0.4g NaOH 加去离子水定容 100ml。 （3）乙腈-0.1 mol/L NaOH 溶液的配制： 84ml 乙腈和 16ml 0.1M NaOH 混合均匀。 （4）1 mol/L HCl 溶液 取 8.6ml 浓 HCl 加纯水定容至 100ml。 5.1 牛奶样品 1） 取 2.0ml 样品至 50nl 离心管中。 2） 加入 8.0ml 样品提取液（乙腈-0.1MNaOH）, 剧烈振荡 15min，4000r/min 离心 10min。 3） 取 2.0ml 上清液在 50℃条件下氮气或空气流吹 至*干燥。 4） 用 1.0ml 正己烷溶解干燥的残留物后，再加入 1.0ml 复溶液溶解混合 30s 5） 4000r/min 离心 10min，离心去除上层正己烷。 6） 取下层液 100μl，加 100μl MEL 稀释缓冲液 A， 用涡旋混合器混匀。 7） 取 50μl 用于分析。 稀释倍数：4 倍5.2 浓缩饲料 1） 将饲料样品研碎，称取 2.0g 粉碎的饲料样品置 于 50ml 离心管中，加入 2.0ml 1mol/L HCl， 加入 16.0ml 纯水，置于多功能旋转混合器上振 荡 10 分钟（或使用高速均质器均质 3 分钟，或 摇床上振荡 40 分钟）。 2） 4000r/min 离心 15min，取出 10.0ml 上清液并用 1mol/L NaOH 将 pH 值调至 6-8。（注：因饲料 样品的不同，加入 1mol/L NaOH 的量有所差异， 根据情况调节，一般加入范围是 0.5ml~1ml 之 间）。 3） 4000r/min 离心 15min。 4） 取上清液 100μl，加 400μl MEL 稀释缓冲液 B， 用涡旋混合器混匀。 5） 取 50μl 进行分析 稀释倍数：50 5.3 组织样品 1） 取 2.0g 匀浆组织样本于 50ml 离心管中。 2） 加入8.0ml乙腈-0.1mol/L NaOH充分振荡5min， 4000r/min 离心 10min。 3） 取 2.0ml 上清液在 50℃条件下氮气或空气流吹 至*干燥。 4） 用 1.0ml 正己烷溶解干燥的残留物后，再加入 1.0ml 复溶液混合 30s，4000r/min 离心 10min， 去除上层正己烷相 5） 取 50μl 下层液用于分析。 稀释倍数：2 6． 酶联免疫分析程序 6.1 测定之前注意事项 1) 使用前将所有试剂平衡至室温（20-25℃）。 2) 使用后迅速将试剂放入 2-8℃冷藏。 3) 在 ELISA 分析中的再现性，很大程度上取决于 洗板的*性，正确的洗板操作是 ELISA 测定 程序中的要点。 4) 所有温育过程应避免阳光直射，并按要求用盖 板覆盖住酶标板。 6.2 溶液的配制 洗涤液的配制：将浓缩洗涤液用纯水稀释 10 倍后 使用。（例如：取 10 ml 浓缩液+90 ml 纯水, 可以用 于 32 孔的检测）。 6.3 测定程序 1) 将足够标准品和样品所用数量的孔条插入酶 标板架，标准品和样品做两个平行实验，记录 下标准和样品的位置。未使用的酶标板用铝箔 袋封好置 2-8℃冷藏保存。 2) 吸取 50μl 标准品或样品分别加至相应的微孔 （双孔）中，然后各加入 50μl 的 MEL 抗体， 加盖，在室温温育 30 分钟（每个标准品和样 品必须使用新的吸头）。 3) 倒出孔中的液体，每孔加入 250μl 稀释好的洗 涤液，置于酶标板振荡器上振荡 30 秒钟（或 者手工振荡），重复操作四次。洗完后用力在 吸水纸上拍干。 4) 然后各加入 100μl 酶标二抗，加盖，在室温温 育 30 分钟（每个标准品和样品必须使用新的 吸头）。 5) 重复洗板步骤 3） 6) 每孔加入100μl显色底物，室温避光温育10分 钟。 7) 每孔加入50μl 终止液。 8) 置于酶标仪中，振荡混匀，在450nm处测定吸 光度值（OD值），参比波长630nm。（iElisa全 自动酶标仪可以直接读出、打印浓度值）。 7. 结果判定 1) 所获得的每个浓度标准溶液和样本吸光度值的 平均值（B）除以*个标准（0 标准）的吸光 度值（B0）再乘以 100%，即百分吸光度值。 百分吸光度值（%）＝ B ×100% B0 以三聚氰胺标准品浓度值（ppb）为 X 轴，百 分吸光度值为 Y 轴，绘制标准曲线图。相对应每一 个样品的浓度可以从标准曲线上读出。也可以用回 归方程法，计算出样本溶液浓度。利用计算机专业 软件，更便于大量样品的快速分析。 2） 样品的实际浓度为读数结果乘以相应稀释倍 数。 3） 如果测定值超出检测范围，样品提取溶液按一 定的比例用相应的稀释缓冲液进行稀释。 8. 注意事项 1) 室温低于20℃或试剂及样品未回到室温（20- 25℃）会导致数值偏低。 2) 在洗板过程中如果出现板孔干燥过久的情况， 则会出现标准曲线不成线性，重复性不好的现象。所以洗板排干后应立即进行下一步操作。 3) 标准物质和显色液对光敏感，避免直接暴露在 光线下。 4) 混合要均匀，洗板要*（包括加样品和标准 液的时候都必需充分混合均匀）。 5) 终止液为强酸性物质，避免接触皮肤。 6) 不要使用过了有效期的试剂盒，也不要混合使 用不同批次的试剂盒，这样会引起测定结果不 准确。 7) 试剂盒的储存条件是2-8℃，切勿冷冻。 9. 试剂盒的性能指标 1）检测限 LOD: 牛奶 5ppb（μg /kg），饲料 50ppb， 组织 2.0ppb。（LOD：空白样品测定值+2 倍标准 偏差 SD） 2）定量限 LOQ: 牛奶 10ppb，饲料 100ppb，组织 4.0ppb。 3 ） 定 量 检 测 范 围 ： 牛 奶 10-1800ppb ，饲料 100-22500ppb，组织 4.0-900ppb 。