iElisa 赭曲霉毒素 A 检测试剂盒 

iElisa 赭曲霉毒素 A 检测试剂盒 

1. 概要 赭曲霉毒素Ａ由 Aspergillus 和 Penicillium 两类霉菌产生，除明显的肾毒性外，赭曲霉毒素 A 还表现出肝毒性、致畸性、致癌性和免疫抑制性等 特性。对人体健康而言，危害不仅来源于污染的植 物性食品，也通过动物性食品的摄入。我国规定谷 物、豆类及其制品中赭曲霉毒素A不得超过5μg/kg， 欧盟规定谷物、豆类及其制品中赭曲霉毒素 A 不得 超过 3μg/kg。 2. 原理 测定的基础是抗原-抗体反应。微孔板上包被有 抗抗体。加入赭曲霉毒素 A（OTA）标准品或样品、 酶标抗原和抗体后，游离的赭曲霉毒素 A 与酶标抗 原竞争结合抗体，抗体或抗体结合物与固定在微孔 板上的抗抗体再结合，没有结合的标准品、酶标抗 原及抗体被洗去，加入 TMB 底物显蓝色，加入终 止液后颜色由蓝变黄，用酶标仪在 450nm 处检测， 吸光值与样品中赭曲霉毒素 A 含量成负相关，与标 准曲线比较即可得出赭曲霉毒素 A 的含量。 3. 试剂盒组成 1) 包被有抗抗体的96微孔板：1块（96孔，12条×8 孔） 2) 赭曲霉标准品：0 ppb、0.2 ppb、0.5 ppb、 1.0 ppb、 2.0 ppb、5.0 ppb 1 瓶 × 1.0ml 3) OTA抗体： 1 瓶 × 10ml 4) OTA酶标抗原： 1 瓶 × 10ml 5) 10× 浓缩洗涤液： 1 瓶 × 50ml 6) OTA稀释缓冲液： 1 瓶 ×50ml 7) 显色底物液： 1 瓶 ×17ml 8) 反应终止液： 1 瓶 × 7ml 9) 试剂盒说明书 10) 质检报告 4. 需要的仪器、试剂 1）仪器 —酶标仪 450nm（iElisa 全自动酶标仪或相当者） —微量移液器：20μl-200μl 单道，100μl-1000μl 单道, 50μl-300μl 八道 —多功能旋转混合器（或者摇床、高速均质器） —酶标板振荡器 —涡旋混合器 —50ml 离心管 —1.5ml 离心管 —定性滤纸 —过滤漏斗 —天平：感量 0.01g 2）试剂 —样品提取液 70%甲醇：取 700ml 甲醇，加 300ml 纯水，混匀。 —纯水（蒸馏水、去离子水） 5. 样品处理 5.1 谷物（玉米、小麦、大麦、大米、大豆）： 1） 称取 5.0g 粉碎样品于 50ml 离心管中，加入 25.0ml 样品提取液 70%甲醇,置于多功能旋转 混合器上振荡 10 分钟（或使用高速均质器均质 3 分钟，或摇床上振荡 40 分钟）。 2） 将提取液用普通滤纸过滤，吸取 200μl 滤液置 于 1.5ml 离心管中，加入 200μl OTA 稀释缓冲 液，用涡旋混合器混匀。 稀释倍数：10 5.2 饲料： 1) 称取 5.0g 粉碎样品于 50ml 离心管中，加入 25.0ml 样品提取液 70%甲醇,置于多功能旋转 混合器上振荡 10 分钟（或使用高速均质器均 质 3 分钟，或摇床上振荡 40 分钟）。 2) 将提取液用普通滤纸过滤，吸取 100μl 滤液置 于 1.5ml 离心管中，加入 400μl OTA 稀释缓冲 液，用涡旋混合器混匀。 稀释倍数：25 5.3 尿液样品： 1) 取 5ml 待检样品于 15ml 离心管中，3000r/min， 离心 10 分钟2) 吸取 100μl 离心后澄清样品置于 1.5ml 离心管 中 3) 加入 400μl OTA 稀释缓冲液，用涡旋混合器混 匀。 稀释倍数：5 6.酶联免疫分析程序 6.1 测定之前注意事项 1) 使用前将所有试剂平衡至室温（20-25℃）。 2) 使用后迅速将试剂放入 2-8℃冷藏。 3) 在 ELISA 分析中的再现性，很大程度上取决于 洗板的*性，正确的洗板操作是 ELISA 测定 程序中的要点。 4) 所有孵育过程应避免阳光直射，并按要求用盖 板覆盖住酶标板。 6.2 溶液的配制 1） 提取液的配制: 根据实验所需的量配制 70%的 甲醇水溶液（水要用纯水、或蒸馏水、去离子 水） 2） 洗涤液的配制：将浓缩洗涤液用去离子水稀释 10 倍后使用（1 份浓缩洗涤液加 9 份蒸馏水）。 6.3 测定程序 1) 将足够标准品和样品所用数量的孔条插入酶 标板架，标准品和样品做两个平行实验，记录 下标准和样品的位置。未使用的酶标板用铝箔 袋封好置 2-8℃冷藏保存。 2) 分别吸取 50μl 标准品和样品加至相应的微孔 （双孔）中，然后各加入 50μl 酶标抗原，再 加入 50μl 抗体，加盖，在室温反应 40min（每 个标准和样品必须使用新的吸头）。 3) 倒出孔中的液体，将微孔架倒置在吸水纸上拍 打以保证*除去孔中的液体，然后每孔加入 250μl 稀释好的洗涤液洗涤，振荡后倒出孔中 的液体，拍干；重复操作四次，洗板时每次间 隔20s，洗完后用力在吸水纸上排干。 4) 每孔加入150μl底物， 室温避光温育15min。 5) 每孔加入50μl 反应终止液，混匀。 6) 置于酶标仪中，振荡混匀，在450nm处测定吸 光度值（OD值），参比波长630nm。（iElisa全 自动酶标仪可以直接读出、打印浓度值）。 7. 结果判定 1) 所获得的每个浓度标准溶液和样本吸光度值 的平均值（B）除以*个标准（0 标准）的吸 光度值（B0）再乘以 100%，即百分吸光度值。 百分吸光度值（%）＝ B ×100% B0 以赭曲霉毒素 A 标准品浓度值（ppb）为 X 轴， 百分吸光度值为 Y 轴，绘制标准曲线图。相对应每 一个样品的浓度可以从标准曲线上读出。也可以用 回归方程法，计算出样本溶液浓度。利用计算机专 业软件，更便于大量样品的快速分析。 2） 样品的实际浓度为读数结果乘以相应的稀释倍 数。 3） 如果测定值超出检测范围，样品提取溶液按一 定的比例用 70%甲醇进行稀释。 8. 注意事项 1) 室温低于20℃或试剂及标本未回到室温（20- 25℃）会导致数值偏低。 2) 在洗板过程中如果出现板孔干燥过久的情况， 则会出现标准曲线不成线性，重复性不好的现 象。所以洗板排干后应立即进行下一步操作。 3) 标准物质和显色液对光敏感，避免直接暴露在 光线下。 4) 混合要均匀，洗板要*（包括加样品和标准 液的时候都必需充分混合均匀）。 5) 反应停止液为强酸性物质，避免接触皮肤。 6) 不要使用过了有效期的试剂盒，也不要稀释或 搀杂使用不同生产厂家的试剂盒这样会引起 灵敏度降低。 7) 试剂盒的储存条件是2-8℃，切勿冷冻。 9. 检测方法灵敏度、准确度、精密度 1) 检测限 LOD: 谷物 1ppb（μg /kg），饲料 2.5ppb 尿液 1.0。（LOD：空白样品测定值+2 倍标准偏 差 SD） 2) 定量限 LOQ: 谷物 2ppb，饲料 5ppb,尿液 1.5ppb。 3) 定量检测范围：谷物 2-50ppb，饲料 5-125ppb, 饲料 1.5-25ppb。