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转基因大豆MON87705品系试剂盒(荧光-PCR法)
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详细信息
转基因大豆MON87705品系试剂盒(荧光-PCR法)
产品名称】
通用名称：转基因大豆 MON87705 品系核酸检测试剂盒 (荧光-PCR 法)
Name ：Diagnostic Kit for MON87705 Gene DNA (Real-Time PCR Method)
【包装规格】50T/盒
本试剂盒适用于检测转基因植物的 MON87705 基因，用于筛查待检测植物中是否含有 MON87705 成分。其检测结果仅供参考。
【检验原理】
本试剂盒用国家标准的 MON87705 特异性引物和探针，用荧光 PCR 技术进行转基因成分的检测。
【试剂组成】
名 称 | 规 格 |
酶液 | 50μL×1 管 |
MON87705 反应液 | 500μL×2 管 |
MON87705 阳性质控品 | 50μL ×1 管 |
阴性质控品 | 250μL ×1 管 |
说明：不同批号的试剂盒组分不可交互使用。
【储存条件及有效期】
-20℃避光保存、运输、避免反复冻融，反复冻融次数不超过 5 次。有效期 12 个月。
【适用仪器】
ABI 、安捷伦 MX3000P/3005P、MJ Opticon2、LightCycler480、Bio-Rad、eppendorf 等系列荧光定量 PCR 检测仪。
【标本采集】称取 200g 样品。【保存和运输】
上述标本短期内可保存于-20℃，长期保存可置-70℃，但不能超过 6 个月，标本运送应采用 0℃。
转基因大豆MON87705品系试剂盒(荧光-PCR法)使用方法】
1. 样品处理（样本处理区）
1.1 样本前处理
固体样本：用粉碎机或冷冻研磨仪将样品研磨至细粉状。
1.2 DNA 提取
对于固体标本，DNA 的提取可以采用 SN/T 2584-2010 中推荐的方法：
1) 每个样品取 2 个平行管。称取 200mg 粉碎的样品，加入 1mL 预冷至 4℃的抽提液，剧烈摇动混匀后，在冰上静止 5min，4℃条件下 10000g 离心 15min，弃上清液；
2) 加入 600μL 预热至 65℃的裂解液，充分重悬沉淀，在 65℃恒温保持 40min， 期间颠倒混匀 5 次；
3) 室温条件下10000g 离心10min，取上清液转移至新离心管中，加入5μLRNAseA， 37℃恒温 30min，分别用等体积苯酚：异戊醇溶液：异戊醇溶液各抽提一次；
4) 室温条件下，10000g 离心 10min，取上清液至新离心管，加入三分之二体积的异丙醇，十分之一体积的 3mol/L 的乙酸钠溶液（pH=6.5），-20℃放置 2-3h；
5) 在 4℃条件下，10000g 离心 15min，弃上清液，用 70%乙醇洗涤沉淀一次，倒出乙醇，晾干沉淀；
6) 加入 50μL TE（pH8.0）溶解沉淀，所得溶解即为样品 DNA 溶液。也可使用等效的 DNA 提取试剂盒。
油脂样本请直接选用市售油脂 DNA 提取试剂盒，按说明操作。
2. 试剂配制（试剂准备区）
根据待检测样本总数，设所需要的 PCR 反应管管数为 N(N=样本数+1 管阴性对照+1 管阳性对照；样品每满 7 份，多配制 1 份)，每测试反应体系配制如下表：
试剂 | MON87705 反应液 | 酶液 |
用量 | 20μL | 1μL |
3. 加样（样本处理区）
将步骤 1 提取的 DNA、阳性质控品、阴性质控品各取 4μL，加入相应的反应管中，盖好管盖，混匀，短暂离心。
4. PCR 扩增（核酸扩增区）
4.1 将待检测反应管置于荧光定量 PCR 仪反应槽内；
1.1 设置好通道、样品信息，反应体系设置为 25μL；荧光通道选择： 检测通道
（Reporter Dye）FAM， 淬灭通道（Quencher Dye）选择 NONE，请勿选择 ROX 参比荧光。
1.2 推荐循环参数设置：
步骤 | 循环数 | 温度 | 时间 | 收集荧光信号 |
1 | 1 cycle | 95℃ | 10min | 否 |
2 | 40 cycles | 94℃ | 15sec | 否 |
55℃ | 30sec | 是 |
转基因大豆MON87705品系试剂盒(荧光-PCR法) 结果分析判定
结果分析条件设定
设置 Baseline 和 Threshold：一般直接按机器自动分析的结果分析，当曲线出现整体倾斜时，根据分析后图像调节 Baseline 的 start 值(一般可在 3~15 范围内调节)、stop 值(一般可在 5~20 范围内调节)，以及Threshold 的 Value 值(上下拖动阈值线至高于阴性对照)，重新分析结果。
结果判断
阳性：检测通道 Ct 值≤35，且曲线有明显的指数增长曲线；
可疑：检测通道 35<Ct 值≤38，建议重复检测，如果检测通道仍为 35<Ct 值≤ 38，且曲线有明显的增长曲线，判定为阳性，否则为阴性；
阴性：样本检测结果 Ct 值>38 或无 Ct 值。
3. 质控标准
阴性质控品：Ct>38 或无 Ct 值显示；
阳性质控品：扩增曲线有明显指数生长期，且 Ct 值≤32； 以上条件应同时满足，否则实验视为无效。
