生物质谱的蛋白鉴定、定量、翻译后修饰分析

实验原理

蛋白质经过蛋白酶的酶切消化后成肽段混合物，在质谱仪中肽段混合物电离形成带电离子,质谱分析器的电场、磁场将具有特定质量与电荷比值(即质荷比, M/Z) 的肽段离子分离开来,经过检测器收集分离的离子,确定每个离子的MZ值。经过质量分析器可分析出每个肽段的MIZ.得到蛋白质所有肽段的M/Z图谱，即蛋白质的--级质谱峰图。离子选择装置自动选取强度较大肽段离子进行二级质谱分析，输出选取肽段的二级质谱峰图，通过和理论.上蛋白质经过胰蛋白酶消化后产生的--级质谱峰图和二级质谱峰图进行比对而鉴定蛋白质。根据离子源的不同，目前用于蛋白分析的主流质谱技术主要有电喷雾离子化质谱(ESHMS) 和基质辅助激光解析电离质谱(ML ADHMS)。质量分析器主要有四极杆分析器(QE).离 子阱分析器(Orbitrap)、飞行时间分析器 (MLADI-TOF) 。

生物质谱在蛋白分析方面的应用

1.蛋白鉴定:由于各种蛋白质的氨基酸序列(--级结构)不同，蛋白质被酶解后产生的肽段序列也各异，肽混合物质量数亦具有特征性，称为肽质量指纹谱(peptide mass fingerprint, PMF) ，可用于蛋白质的鉴定。

2.蛋白定量:基于稳定同位素标记法，如SIL AC. QconCAT. iTRAQ等;基于质谱归--化的非标定量法，如蛋白丰度指数法PAI、多肽匹配数、谱图计数、碎片离子峰强度(iBAQ) , SWATH等。

3.蛋白翻译后修饰:根据特定修饰基团的图谱特点进行翻译后修饰的鉴定和定位，包括磷酸化、糖基化、巯基和二硫键定

位、乙酰化、泛素化等。

实验步骤

①组织或细胞蛋白提取;

②蛋白酶消化，将蛋白样品制备成多肽;

③多肽抽提和质谱仪分析，产生肽段质荷比和肽离子质量;

④搜库、打分、输出排序;

⑤搜库后分析，蛋白鉴定、定量或翻译后修饰分析。

实验完成周期及交付标准

1.实验完成周期10~30天,

2.交付标准:

①主要仪器、试剂和实验方法:

②包含protein ID. gene symbol. spectrum count. u-peptide. z-score.、 coverage等信息的蛋白鉴定列表;

③所有肽段信息表;

④质谱原始数据(raw data)。

需确认的信息

1.样品:①如果样品为蛋白质溶液，蛋白质总量≥300mg ;

②.如果是组织样品，样品总量≥0.1g;如果是细胞样品，细胞数量≥107个;

③、如果是体液样品，血清≥200ml,脑脊液≥200ml,尿液≥1ml, 泪液≥1ml;

2.样品采集过程中使用到塑料制品时，尽量使用无色产品，以减少塑料制品中杂质对质谱检测的影响;

3.确认样品所属种属、分析需求。

文献参考

[1]Liu Q, et al. In-depth proteomic characterization of endogenous nuclear receptors in mouse liver. Mol Cell Proteomics.2013;12(2):473-84.

[2]Ruprecht B, et al. MALDI-TOF and nESI Orbitrap MS/MS identify orthogonal parts of the phosphoproteome.

Proteomics.2016;16(10);:1447-56.

[3]Kobayashi D, et al. Identification of a specific translational machinery via TCTP-EF1A2 interaction regulating NF1-associated tumor growth by afinity purification and data-independent mass spectrometry acquisition (AP-DIASWATH).Mol Cell Proteomics.2018 Oct 31. PubMed PMID: 30381327.