SOLARBIO/索莱宝 品牌
生产厂家厂商性质
北京市所在地
DPPH自由基清除能力检测试剂盒说明书
可见分光光度法
货号：BC4750
规格：50T/24S
产品内容：使用前请认真核对试剂体积与瓶内体积是否一致，有疑问请及时联系索莱宝工作人员。
试剂名称 | 规格 | 保存条件 |
提取液 | 液体50 mL×1瓶 | 2-8℃保存 |
试剂一 | 液体60 mL×1瓶（自备） | 常温保存 |
试剂二 | 粉剂×1瓶 | 2-8℃保存 |
试剂三 | 粉剂×1支 | 2-8℃保存 |
溶液的配制：
1、 试剂一：无水乙醇自备；
2、 试剂二：粉剂置于瓶内EP管中。临用前加入6.08 mL试剂一振荡溶解，用不完的试剂可于-20℃保存1个月，建议分装保存，避免反复冻融；临用前根据试验所需量按照试剂二：试剂一（V:V）= 4：21的比例配制成工作液，现配现用，用不完的工作液可于2-8℃保存一周；
3、 试剂三：10 mg维生素C。临用前加入1 mL提取液，充分振荡溶解，配成10 mg/mL维生素C溶液，2-8℃保存两周；用于阳性对照。
产品说明：
DPPH自由基一种很稳定的氮中心的自由基，是样本抗氧化能力的重要指标之一，广泛应用于抗氧化类食品、保健品及药品的研究中。
DPPH自由基有单电子，其醇溶液呈紫色，在515 nm处有强吸收。当有抗氧化剂存在时，DPPH自由基被清除，其溶液颜色变浅，515 nm的吸光度下降，在一定范围内其吸光度的变化与自由基被清除的程度成正比。本试剂盒中，通过吸光度下降的程度来反映样本清除DPPH自由基的能力。
注意：实验之前建议选择2-3个预期差异大的样本做预实验。如果样本吸光值不在测量范围内建议稀释或者增加样本量进行检测。
需自备的仪器和用品：
可见分光光度计、1 mL玻璃比色皿、恒温水浴锅、台式离心机、无水乙醇、研钵/粉碎机、烘干箱、30~50目筛和蒸馏水。
操作步骤：
一、样本的制备（可适当调整待测样本量，具体比例可以参考文献）
（1）植物样本的制备：将新鲜样本置于60℃烘箱烘干至恒重，研钵研碎（或粉碎机粉碎），过30~50目筛。称取约0.05 g样本，加入1 mL提取液，40℃水浴浸提30 min。室温10000 rpm 离心10 min，取上清，置冰上待测。
（2）红酒、果汁等液体样本：吸取100 μL样本溶液加入900 μL提取液，旋涡振荡混匀，室温10000 rpm 离心10 min，取上清，置冰上待测。
（3）提取物或者药物：可用提取液配制成一定浓度，如5 mg/mL。
注意：不同样本清除DPPH自由基的能力可能相差很大，为保证实验结果的准确性，样本要根据预实验结果进行适当调整（如清除率大于90%，建议将提取的样本用提取液进行稀释；清除率小于5%，建议加大烘干样本
质量或液体样本体积进行提取）。
二、测定步骤
1、分光光度计预热30 min以上，调节波长至515 nm，无水乙醇调零。
2、阳性对照的准备：若需要线性关系，建议将10 mg/mL的维生素C溶液用提取液配制成0.3、0.25、0.125、0.0625、0.03125、0.015625 mg/mL的维生素C溶液待用，稀释可参考下表；若需要清除率约为100%的阳性对照，则建议将10 mg/mL维生素C溶液用提取液配制成大于0.3 mg/mL的维生素C溶液待用。
序号 | 稀释前浓度（mg/mL） | 试剂三体积（µL） | 提取液体积（µL） | 稀释后浓度（mg/mL） |
1 | 10 | 100 | 900 | 1 |
2 | 1 | 300 | 700 | 0.3 |
3 | 0.3 | 500 | 100 | 0.25 |
4 | 0.25 | 300 | 300 | 0.125 |
5 | 0.125 | 300 | 300 | 0.0625 |
6 | 0.0625 | 300 | 300 | 0.03125 |
7 | 0.03125 | 300 | 300 | 0.015625 |
备注：实验中每个阳性对照管需25µL试剂三。
3、操作表：在1.5 mL EP管中分别加入下列试剂
试剂名称（μL） | 空白管 | 测定管 | 对照管 | 阳性对照管 |
上清液 | - | 25 | 25 | - |
试剂三 | - | - | - | 25 |
提取液 | 25 | - | - | - |
试剂一 | - | - | 975 | - |
工作液 | 975 | 975 | - | 975 |
涡旋混匀，室温避光静置30 min，于515 nm处的吸光度。分别记为A空白、A测定、A对照、A阳性对照。每个测定管需设一个对照管。阳性对照管和空白管只需测1-2次。 | ||||
三、计算公式
1、阳性对照的自由基清除率计算公式：
DPPH自由基清除率DVC% =[(A空白-A阳性对照)÷A空白]×100%
2、样本的自由基清除率计算公式：
DPPH自由基清除率D% =[[A空白-(A测定-A对照)]÷A空白]×100%
注意事项：
1、不同样本清除DPPH自由基的能力可能相差很大，如果要比较不同样本的DPPH自由基清除能力，建议对于同一批样本加入等量的样本，红酒、组织匀浆、果汁等液体样本加入同样体积，提取物（或者药物）配制成同样浓度。在比较时，将样本根据预实验结果进行适当调整，比较同样浓度（相同稀释倍数）的清除率大小。
2、样本建议当天提取当天检测。
实验实例：
1、 称取0.05g益母草叶片加入1mL提取液进行样本处理，离心取上清后按测定步骤操作，测得A空白=1.037、A对照=0.088、A测定=0.228，根据计算公式得：
DPPH自由基清除率D% =[[A空白-(A测定-A对照)]÷A空白]×100%=86.5%。
2、 取100μL红酒加入900μL提取液进行样本处理，离心取上清后按测定步骤操作，测得A空白=1.037、A对照=0.012、A测定=0.760，根据计算公式得：
DPPH自由基清除率D% =[[A空白-(A测定-A对照)]÷A空白]×100%=27.9%。
3、 称取0.05g枸杞加入1mL提取液进行样本处理，离心取上清稀释20倍后按测定步骤操作，测得A空白=1.037、A对照=0.005、A测定=0.829，根据计算公式得：
DPPH自由基清除率D% =[[A空白-(A测定-A对照)]÷A空白]×100%=20.5%。
相关系列产品：
BC1310/BC1315 总抗氧能力（T-AOC）检测试剂盒
BC1320/BC1325 羟自由基清除能力检测试剂盒
DPPH自由基清除能力检测试剂盒 抗氧化 DPPH自由基清除能力检测试剂盒 抗氧化
