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北京市所在地
ABTS自由基清除能力检测试剂盒说明书
可见分光光度法
货号：BC4770
规格：50T/24S
产品内容：使用前请认真核对试剂体积与瓶内体积是否一致，有疑问请及时联系索莱宝工作人员。
试剂名称 | 规格 | 保存条件 |
提取液 | 液体60 mL×1瓶 | 2-8℃保存 |
试剂一 | 液体80 mL×1瓶 | 2-8℃保存 |
试剂二 | 粉剂×1瓶 | 2-8℃保存 |
试剂三 | 液体20 μL×1支 | 2-8℃保存 |
试剂四 | 液体1.5 mL×1支 | -20℃保存 |
试剂五 | 粉剂×1支 | 2-8℃保存 |
溶液的配制：
1、 试剂二：临用前加入3 mL蒸馏水，充分溶解；用不完的试剂可分装后保存，-20℃可保存四周，避免反复冻融；
2、 试剂三工作液的配制：液体置于试剂瓶内EP管中。临用前根据样本量按试剂三（μL）：蒸馏水（mL）=1μL:12mL（注意单位）的比例配成试剂三工作液，现用现配，用多少配多少，尽量在4h之内用完；
3、 试剂四工作液的配制：可先将试剂四-20℃分装保存。临用前根据样本量按试剂四：试剂一（V:V）=1:9的比例配成试剂四工作液，现配现用，现配现用，用不完的试剂放于-20℃可保存两周。
4、 试剂五：含有5 mg维生素C。临用前加入2.8 mL提取液，充分振荡溶解；配成10 mmol/L维生素C溶液，用于阳性对照。2-8℃可保存两周。
5、 ABTS工作液的配制：临用前根据样本量按试剂一：试剂二：试剂三工作液（V:V:V）=76:5:4的比例配成ABTS工作液，现用现配，室温避光保存，务必在30分钟内使用。
产品说明：
ABTS法可用于亲水性和亲脂性物质抗氧化能力测定，是使用广泛的间接检测方法。ABTS经氧化后生成稳定的蓝绿色阳离子ABTS自由基，在405 nm或734 nm处有最大吸收峰。被测物质加入ABTS自由基溶液后，所含抗氧化成分能与ABTS自由基发生反应而使反应体系褪色，405 nm的吸光度下降，在一定范围内其吸光度的变化与自由基被清除的程度成正比。本试剂盒中，通过测定吸光度下降的程度来反映样本清除ABTS自由基的能力。
注意：实验之前建议选择2-3个预期差异大的样本做预实验。如果样本吸光值不在测量范围内建议稀释或者增加样本量进行检测。
需自备的仪器和用品：
可见分光光度计、1 mL玻璃比色皿、恒温水浴锅、台式离心机、研钵/粉碎机、烘干箱、30~50目筛、冰、蒸馏水。
操作步骤：
一、样本处理（可适当调整待测样本量，具体比例可以参考文献）
1、植物组织样本的制备：将新鲜样本置于60℃烘箱烘干至恒重，研钵研碎（或粉碎机粉碎），过30~50目筛；称取约0.05 g样本，加入1 mL提取液后置于40℃水浴锅中浸提30 min；10000 rpm 室温离心10 min，取上清，置于冰上待测。
2、红酒、果汁等液体样本：吸取100 μL样本溶液加入900 μL提取液，旋涡振荡混匀，室温10000 rpm离心10 min，取上清，置冰上待测。
3、提取物或者药物：可用提取液配制成一定浓度，如5 mg/mL。
注意：不同样本清除ABTS自由基的能力可能相差很大，为保证实验结果的准确性，样本要根据预实验结果进行适当调整（如清除率大于90%，建议将提取的样本用提取液进行稀释；清除率小于5%，建议加大烘干样本质量或液体样本体积进行提取）。
二、测定步骤
1、分光光度计预热30 min以上，调节波长至405 nm，蒸馏水调零。
2、阳性对照的准备：若需要线性关系，建议将10 mmol/L的维生素C溶液用提取液配制成0.4、0.2、0.1、0.05、0.025、0.0125 mmol/L的维生素C溶液待用，稀释可参考下表；若需要清除率约为90%的阳性对照，则建议将10 mmol/L维生素C溶液用提取液配制成大于1 mmol/L的维生素C溶液待用。
序号 | 稀释前浓度（mmol/L） | 维生素C溶液体积（µL） | 提取液体积（µL） | 稀释后浓度（mmol/L） |
1 | 10 | 100 | 900 | 1 |
2 | 1 | 80 | 120 | 0.4 |
3 | 0.4 | 100 | 100 | 0.2 |
4 | 0.2 | 100 | 100 | 0.1 |
5 | 0.1 | 100 | 100 | 0.05 |
6 | 0.05 | 100 | 100 | 0.025 |
7 | 0.025 | 100 | 100 | 0.0125 |
备注：实验中每个阳性对照管需50µL维生素C溶液。
3、操作表：在EP管中分别加入下列试剂：
试剂名称（μL） | 空白管 | 测定管 | 对照管 | 阳性对照管 |
上清液 | - | 50 | 50 | - |
不同浓度的VC溶液 | - | - | - | 50 |
蒸馏水 | 50 | - | - | - |
试剂四工作液 | 100 | 100 | - | 100 |
ABTS工作液 | 850 | 850 | - | 850 |
试剂一 | - | - | 950 | - |
充分混匀，室温避光静置6 min。测定405 nm处的吸光度。分别记为A空白、A测定、A对照、A阳性对照，阳性对照管和空白管只需测1-2次。 | ||||
三、ABTS自由基清除率的计算
1. 阳性对照的自由基清除率计算公式：
ABTS自由基清除率DVC% =[(A空白-A阳性对照)÷A空白]×100%。
2. 样本的自由基清除率计算公式：
ABTS自由基清除率D% =[A空白-(A测定-A对照)]÷A空白×100%。
注意事项：
1、不同样本清除ABTS自由基的能力可能相差很大，如果要比较不同样本的ABTS自由基清除能力，建议对于同一批样本加入等量的样本，红酒、组织匀浆、果汁等液体样本加入同样体积，提取物（或者药物）配制成同样浓度。在比较时，将样本根据预实验结果进行适当调整，比较同样浓度（相同稀释倍数）的清除率大小。
2、样本建议当天提取当天检测。
实验实例：
1、 取0.0502 g菠菜叶片加入1 mL提取液进行匀浆研磨，离心取上清后按照测定步骤操作，使用玻璃比色皿测定吸光值，计算清除率得：
D% =[A空白-(A测定-A对照)]÷A空白×100% =[1.095-(0.352-0.305)]÷1.095×100%=95.71%。
2、 取0.2 mmol/L VC阳性对照管按照测定步骤操作，使用玻璃比色皿测定吸光值，计算清除率得：
DVC% =[(A空白-A阳性对照)÷A空白]×100% =[1.095-0.657]÷1.095×100%=40%。
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