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北京市所在地
Caspase-4活性检测试剂盒说明书
比色法
货号：BC3840
规格：20T、50T、100T
产品组成：使用前请认真核对试剂体积与瓶内体积是否一致，有疑问请及时联系索莱宝工作人员。
20T | 50T | 100T | 保存条件 | |
试剂一 | 液体20 mL×1瓶 | 液体20 mL×1瓶 | 液体25 mL×1瓶 | -20℃保存 |
试剂二 | 液体30 mL×1瓶 | 液体60 mL×1瓶 | 液体120 mL×1瓶 | |
试剂三 | 液体0.55 mL×1支 | 液体0.55 mL×2支 | -20℃保存 | |
标准品 | 液体1mL×1支 | 液体1 mL×1支 | 液体1 mL×1支 | -20℃保存 |
溶液的配制：
1、 试剂一：分装-20℃保存。
2、 试剂二：分装-20℃保存。
3、 标准品：pNA标准溶液，5 mmol/L。标准溶液在4℃条件下为浑浊状态，溶解即可变为澄清状态，不影响使用。
4、 标准品稀释液配制：取9 mL试剂一加入1 mL试剂二，充分混匀待用。（也可按照试剂一：试剂二=9:1的比例，自行配制）。
产品说明：
Caspase是参与细胞凋亡过程的蛋白酶家族，包含10多个成员。Caspase-4可以和Apaf-1相互作用，并参与细*素c导致的Caspase-3激活，也可以和caspase-14相互作用。
试剂盒测定原理基于Caspase-4特异水解其多肽底物Ac-LEVD-pNA，释放出游离的硝基苯胺pNA，后者呈黄色在405 nm具有最大吸收峰，采用可见光光度比色法测定。
注意：实验之前建议选择2-3个预期差异大的样本做预实验。如果样本吸光值不在测量范围内建议稀释或者增加样本量进行检测。
需自备的仪器和用品：
可见分光光度计/酶标仪、100μL玻璃比色皿/96孔板、台式离心机、水浴锅/恒温培养箱、可调式移液器、研钵/匀浆器、冰和蒸馏水。
操作步骤：
一、样本处理（可适当调整待测样本量，具体比例可以参考文献）
1、培养细胞：先收集细胞到离心管内，离心后弃上清；按照细胞数量（约106个）加100μL试剂二（若裂解不充分可提高至150-200 μL），震荡重悬沉淀，置冰上静置15 min，4℃，15000g离心10-15min，取上清置冰上待测。
2、组织：按照组织质量（g）：试剂二体积（mL）为1：5~10的比例（建议称取约0.1 g组织，加入1 mL试剂二），冰浴研磨或充分剪碎，置冰上静置15 min，4℃，15000g离心10-15min，取上清置冰上待测。
二、测定步骤
1、 可见分光光度计/酶标仪预热30min以上，调节波长至405nm，蒸馏水调零。
2、 临用前用标准品稀释液将5 mmol/L pNA标准品稀释至200、100、50、25、12.5、0μmol/L的标准溶液待用。
3、 样本测定（在96孔板/EP管中按顺序加入以下试剂）
试剂名称（μL） | 测定管 | 空白管 | 标准管 |
试剂一 | 40 | 40 | |
样本 | 50 | ||
试剂二 | 50 | ||
试剂三 | 10 | 10 | |
标准溶液 | 100 | ||
混匀，盖紧96孔板盖子并用封口膜密封。37℃孵育60-120分钟。发现颜色变化比较明显时即可测定405nm处吸光值。如果颜色变化不明显，可以适当延长孵育时间，甚至可以孵育过夜。空白管只需做1-2次。计算ΔA测定=A测定管-A空白管。 | 立即测定405nm下吸光度 | ||
三、Caspase-4活性计算
1. 标准曲线的建立：
根据标准管的浓度（x，μmol/L）和ΔA标准（y，减去浓度为0的空白管）做标准方程。将ΔA测定代入标准方程得到x（μmol/L）。
2. 按酶活性增加百分比计算
Caspase-4活性增加百分比=（实验处理组A测定-A空白管）/（实验对照组A测定-A空白管）×100%
该方法简单可靠，可粗略反应酶活性情况。
3. 按酶活计算
参考Chemicon公司的caspase酶活力单位的定义：One unit is the amount of enzyme that will cleave 1.0 nmol of the colorimetric pNA-substrate per hour at 37℃ under saturated substrate concentrations。即一个酶活力单位定义为当底物饱和时，在37℃一个小时内可以剪切1nmol pNA底物产生1nmol游离 pNA的酶量。这样就可以计算出样本中含有多少个酶活力单位的caspase酶活性。
Caspase-4活性（U/mg prot）=x×V反总÷（V样×Cpr）÷T×103=2x÷Cpr÷T
V反总：反应体系总体积，0.1mL=10-4L；V样：加入的样本体积，0.05mL；T：反应时间，h；Cpr：样本蛋白质浓度，mg/mL；103：单位换算系数，1μmol =103nmol。
注意事项：
1、由于试剂二中含有还原剂（DTT），建议将样本用水稀释2倍后，用Bradford法测定蛋白浓度，以降低DTT对蛋白浓度测定的干扰。不建议使用BCA法测定蛋白浓度。
2、Caspase活性测定值低最常见的原因是细胞未发生凋亡或细胞量太少，其次是观测时间不恰当。诱导凋亡时，并非剂量越大时间越长Caspase活性就越高。建议设置不同剂量和时间点如0、2、4、8、16、24小时，以检测最佳的观察点。
3、所测样本的值高于标准曲线上限，可用试剂二稀释样本后重新测定
4、盖紧96孔板盖子并用封口膜密封。37ºC孵育，肉眼可见颜色变黄时的OD405值约为0.2，此时即可测定。颜色变化不明显可延长反应或过夜，但酶活性较强时，孵育时间过长将导致反应失去线性关系。
参考文献：
[1] Cohen GM. Caspases: the executioners of apoptosis. Biochem J, 1997, 326: 1-16.
[2] Janicke R U, Sprengart M L, Wati M R, et al. Emerging role of caspase-3 in apoptosis[J]. Cell Death and Differentiation, 1999, 6:99-104.
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