氯霉素酶联免疫（ELISA）快速检测试剂盒
1 概要
氯霉素 （Chloramphenicol, CAP） 是一种广谱抗生素。具有良好的抗菌效果且价格低廉，广泛应用于家畜禽的各种传染性疾病的治疗。但是氯霉素有严重的副作用，它已被证实会抑制人体骨髓造血功能而引起再生障碍性贫血症和粒状白细胞缺乏症等。近年来，食品中的氯霉素残留对人类的健康造成了*的威胁。因此，发展快速、简便而且又准确的氯霉素检验试剂成为了近年来食品分析界十分关注的课题。传统上常用HPLC 与TLC 来作为抗生素检测的方法，但效率低、灵敏度也达不到要求。本公司研发的氯霉素酶联免疫检验试剂盒，操作简便、耗时短、检测样品多，特异性高，且检测敏感度zui低可达0.025ppb。
本试剂可用于检测生乳、蜂蜜、蜂王浆、鱼、虾、蟹、乌贼、鸡肉、猪肉、饲料及血清等的氯霉素残留。
2 原理
本试剂盒采用直接竞争ELISA 法检测样本中氯霉素。在微孔板上预包被抗氯霉素抗体，样本或标准品溶液中的氯霉素和HRP 标记的氯霉素竞争结合微孔板中抗氯霉素抗体，洗涤后用底物显色，样本吸光值与其所含氯霉素成负相关，与标准曲线比较即可得出样本中氯霉素的含量。
3 试剂盒组份
每个试剂盒中的试剂可进行48 个测定（包括标准测定），试剂盒组份：
CAPAb 酶标板------------------------------48 孔（包被有抗氯霉素抗体）
氯霉素标准品溶液-----------------------------6 瓶（1.5 mL/瓶）
0 号：0 ppb ；1 号：0.025 ppb ；2 号：0.05 ppb ；3 号：0.1 ppb ；4 号：0.3 ppb ；
5 号：0.6 ppb
氯霉素酶标记物----------------------------------1 瓶（8mL）
10×浓缩洗涤液----------------------------------1 瓶（30mL）
10×浓缩提取剂----------------------------------1 瓶（30mL）
底物溶液----------------------------------------1 瓶（12mL）
终止液------------------------------------------1 瓶（12mL）
封板膜------------------------------------------3 张
说明书------------------------------------------1 份
质检报告----------------------------------------1 份
4 另外所需仪器和试剂
4.1 仪器
— 微孔板酶标仪（450nm）
— 振荡器
— 均质机
— 离心机，离心管和玻璃试管
— 可调式5μL-50μL、 20μL-200μL 和100μL-1000μL 微量移液器
— 氮吹仪
4.2 试剂
— 乙酸乙酯（Ethyl acetate）
— 正己烷（n-Hexane）
— 0.5 N 盐酸溶液（HCl）
— 0.5 N 氢氧化钠溶液（NaOH）
5 样本处理
5.1 待测物为生乳，请先参考注意事项第9，10点
− 现配1×提取剂：10×浓缩提取剂用蒸馏水稀释10 倍后使用。（如1 mL 浓缩稀释液加9 mL
蒸馏水稀释）
− 取250μL 乳品于1.5mL 离心管
− 加入750μL 现配1×提取剂，快速震荡30秒钟后备用
稀释倍数: 4
5.2待测物为蜂蜜
− 取2 g蜂蜜、4mL蒸馏水与4mL乙酸乙酯于15mL离心管中，震荡30秒
− 持续上下颠倒该离心管10分钟，使其充分混合均匀
− 以5000rpm离心10分钟，取1 mL上层液（乙酸乙酯）至10mL玻璃试管中，于50℃下，利用氮
气将有机溶相吹干
− 加入0.5 mL 1×提取剂，震荡30秒钟后备用
稀释倍数: 1
5.3 待测物为蜂王浆
− 取2g蜂王浆、3mL 0.5M NaOH及8 mL乙酸乙酯置入15mL离心管中，震荡30秒
− 持续上下颠倒该离心管10 分钟，使其充分混合均匀
− 以5000rpm离心10分钟，取2mL上层液（乙酸乙酯）至10 mL玻璃试管中，于50 ℃下，利用氮
气将有机溶相吹干
− 加入0.5 mL1×提取剂，震荡30秒钟后备用
稀释倍数: 1
5.4 待测物为鱼、虾、蟹、乌贼、鸡肉、猪肉及血清
− 将3克已均质的样品放入15mL离心管中，再加入6mL乙酸乙酯，震荡5分钟
− 以5000rpm离心10分钟，取2mL上层液（乙酸乙酯）至10mL玻璃试管中，于50℃下，利用氮气将有机溶相吹干
− 于此玻璃试管中加入正己烷1mL，先将残余物*溶解后，再加入1mL 1×提取剂，震荡30
秒钟
− 以5000rpm离心10分钟，吸去包含中间乳化层的上层液（正己烷），再吸取下层液（水层）备
用
稀释倍数: 1
5.5 待测物为白虾
− 将6克已均质的样品放入15mL离心管中，再加入6 mL乙酸乙酯，震荡5分钟
− 以5000rpm离心10分钟，取4mL上层液（乙酸乙酯）至10 mL玻璃试管中，于50℃下，利用氮
气将有机溶相吹干
− 于此玻璃试管中加入正己烷2mL，先将残余物*溶解后，再加入0.5mL 1×提取剂，震荡30秒钟
− 以5000rpm离心10分钟，吸去包含中间乳化层的上层液（正己烷），再吸取下层液（水层）备
用稀释倍数: 0.125
5.6 待测物为饲料
− 取2 g饲料与4 mL乙酸乙酯置入15mL离心管中，震荡30秒
− 持续上下颠倒该离心管10分钟，使其充分混合均匀
− 以5000rpm离心10分钟，取1mL上层液（乙酸乙酯）至10mL玻璃试管中，于50℃下，利用氮气将有机溶相吹干
− 于此玻璃试管中加入正己烷1mL，先将残余物*溶解后，再加入0.5mL 1×提取剂，震荡30秒钟
− 以5000rpm离心10分钟，吸去包含中间乳化层的上层液（正己烷），再吸取下层液（水层）稀
释10倍后（如50μL下层液加450μL 1×提取剂）备用
稀释倍数: 10
5.7 待测物为全蛋
− 取1 g全蛋液，加入0.5N HCl 0.5 mL后快速震荡30秒
− 加入4mL乙酸乙酯后快速震荡30秒使其混合均匀
− 以5000rpm离心10分钟，取2mL上层液（乙酸乙酯）至10mL玻璃试管中，于50 ℃下，利用氮
气将有机溶相吹干
− 于此玻璃试管中加入正己烷1mL，先将残余物*溶解后，再加入0.5mL 1×提取剂，震荡30秒
− 以5000rpm离心10分钟，吸去包含中间乳化层的上层液（正己烷），再吸取下层液（水层）备
用。
稀释倍数: 1
注1：若乳化现象太严重，看不到下层液有澄清部分，请先将玻璃试管中大部分上层液取出，
剩余乳化部份用80～100℃水浴3分钟后再离心。
注2：因为利用乙酸乙酯萃取的流程可能有溶剂的背景值过高的现象，建议做一个溶剂背景
值的样品。待测物的浓度等于所得浓度减去溶剂背景值的浓度再乘以稀释倍数。
注3：得到溶剂背景值的浓度的方法：不加待测物，从把适量的乙酸乙酯移入玻璃试管中做
起到完成整个提取流程，后用于检测。
6 注意事项
Ø 试剂盒保存于2-8°C，不能冷冻，未用的微孔板放回原铝箔袋密封后2-8°C 存放，并
尽快使用，底物溶液要避光保存。
Ø 使用之前，将样本及所需试剂的温度平衡至20-25°C，否则可能导致后面检测吸光度
值偏低。试剂使用完后应立即放回2-8°C 冰箱。
Ø 10×提取剂与10×洗涤液用蒸馏水稀释10 倍后使用。（如1 mL 浓缩液加9 mL 蒸馏水），
1×提取剂和1×洗涤液可于4 ℃保存一周。
Ø 提取流程请使用 P.P.材质的15 mL 离心管以免腐蚀。
Ø 反应终止液含0.5 N HCl，请小心操作。
Ø 氯霉素标准溶液含氯霉素，请小心操作。
Ø 不要使用过期的试剂盒，不同批号试剂不能混用。
Ø ELISA 所得的氯霉素浓度若低于该样品检品敏感度即可视为该样品背景值，无须回乘稀
释倍数。若所得的氯霉素浓度高于该样品检品敏感度，即可能为氯霉素阳性样品，建议
使用其它检测方法检测，如GC/MS 等。
Ø 进行生乳的样本制备时，在 ELISA 操作时中充分混匀（操作步骤的第四点）。
Ø 阴性生乳的OD450 吸光值可能会高于标准品0 ppb 的吸光值但不会影响对氯霉素阳性
样本的判定。
7 检测步骤
7.1 取好所需板条固定于板架后编号，建议每个标准品溶液和待测样本均做复孔。
7.2 加样：每孔加入标准品溶液或样本提取液100μL，然后每孔分别加入氯霉素酶标记物
50μL。
7.3 温育：轻轻振荡混匀，用封板膜封板后置于室温避光反应1小时。
7.4 洗涤：小心揭开封板膜，将孔内液体甩干，加入1×洗涤工作液250 μL/孔，充分洗涤3
次，每次间隔小于5 秒，用吸水纸拍干（拍干后未被清除的气泡可用干净的枪头戳破）。
7.5 显色：每孔加入底物溶液100μL，轻轻振荡混匀，室温下避光静置20 分钟。
7.6 测定：每孔加入终止液100μL，轻轻振荡混匀，5 min 内测定450 nm 处吸光度值。
8 结果判定
8. 1 计算B/B0
所获得的标准品溶液或待测样本的吸光值（B）除以0 号标准品溶液的吸光值（B0）再乘以*，即为百分吸光值。
百分吸光值（%）= B/B0× *
式中：B — 标准品溶液或待测样本的吸光值
B0 — 0 号标准品溶液的吸光值
8.2 绘制标准曲线，计算样本中氯霉素浓度
以氯霉素标准品溶液浓度为X 轴，对应的百分吸光值为Y 轴，在半对数坐标纸上绘制标准曲线。相对应每一个样本的浓度可以从标准曲线上读出。也可以用回归方程法，计算出样本中氯霉素的浓度。
9 检测限、准确度、精密度、特异性
试剂盒灵敏度：0.025 ppb
各样本zui低检测限：
生乳、蜂蜜、蜂王浆：0.1 ppb
血清、蛋、鱼虾蟹鸡猪肉：0.025 ppb
饲料：0.25ppb
回收率（准确性）：
生乳（添加0.25 ppb） 70～110%
蜂蜜（添加0.1 ppb） 90～130%
蜂蜜（添加0.3 ppb） 90～130%
蜂王浆（添加0.3 ppb） 80～120%
鱼、虾、蟹、乌贼、鸡及猪肉（添加0.1 ppb） 75～125%
鱼、虾、蟹、乌贼、鸡及猪肉（添加0.3 ppb） 75～125%
饲料（添加2.0 ppb） 90～130%
血清（添加0.3 ppb） 80～120%
蛋（添加0.3 ppb） 80～120%
精密度：
试剂盒变异系数小于10%
交叉反应率（特异性）：
Chloramphenicol ····························· *
Chloramphenicol（free base） ························ 1.4%
Gentamicin ······························· <0.1%
Thiamphenicol ······························ 3.1%
Tetracycline ······························ <0. 1%
Penicillin ······························· <0.1%
Sulfamethazine ····························· <0.1%
10 储存条件
2-8°C 贮存。
11 有效期
未开封试剂盒有效期为12 个月，开封后3 个月内用完。（见包装盒上标签有效期）____
