PKC活性检测实验

实验试剂:琼脂糖(Promega公司，V3125) ;其他常备试剂购自sigma公司; PKC活性检测试剂盒

(Promega公司，V5330)

实验仪器:电泳仪(北京六一厂，112-0640) ;水平电泳槽(北京六一厂，122-3146) ;电热恒温培养箱(碧云天生物，EBI025) ;电热恒温水浴锅(江苏省金坛市环宇科学仪器厂，HH-8)

基本原理:分离PKC蛋白(磷酸化蛋白及非磷酸化蛋白)，利用试剂 盒组分将2种蛋白分离并加以区分,利用电泳琼脂糖凝胶技术显示2种不同的蛋白，利用分析软件将显示的不同蛋白定量并加以比较，以磷酸化PKC非磷酸化PKC灰度值IOD的比值显示PKC活性(PKC活化度)。

操作步骤:

1.用预冷的匀浆器把细胞匀浆。

2.在4°C，用14,000 xg离心裂解液5分钟，保存上清。

3.用PKC抽提液预平衡1ml的DEAE纤维素柱，再把第2步中得到的上清过柱。用5m的PKC抽提液洗柱子，然后用5ml含有200mM NaCI的PKC抽提液洗脱含有PKC的组分。

4.用PKC稀释液(PKC dilution buffer)将少量蛋白激酶C (Promtein Kinase C)稀释到2 .5ug/ml.随试剂盒所附的产品信息中标有这个酶的初始浓度。

5.用探头超声波破碎仪超声处理PKC Activator Solution 20-30秒,或直到溶液变温暖。

6.对每一个样品，按照下面所列顺序在0.5ml小离心管中混合PepTag@ PKC 5x Buffer,PepTag@ C1Peptide,超声过的PKC Activator 5X Solution,和水。在样品加入之前，小离心管-直要放在冰上。阴性对照将用于对反应进行定量时确定其摩尔吸收值(说明书第IV.部分) 。

标准PKC检测

PepTag@ PKC Reaction 5X Buffer           5ul

PepTag@ C1 Peptide (0.4ug/ul)            5ul

PKC Activator 5X Solution,超声处理的      5ul

短肽保护液(非必须)                    1ul

样品                                 9ul

去离子水使终体积为                   25ul

PKC阳性对照检测

PepTag⑧PKC Reaction 5X Buffer          5ul

PepTag@ C1 Peptide (0 4ug/ul)           5ul

PKC Activator 5XSolution,超声处理的      5ul

短肽保护液(非必须)                   1ul

Protein Kinase C (2.5ug/ml溶于PKC dilution bufer)     4ul

去离子水使终体积为                  25ul

PKC阴性对照检测(不加PKC)

PepTag@ PKC Reaction 5X Buffer         5ul

PepTag@ C1 Peptide (0 4ug/ul)          5ul

PKC Activator 5XSolution,超声处理的     5ul

短肽保护液(非必须)                  1ul

去离子水使终体积为               25ul

7.在0时间点，把-支管子从冰上移到30°C水浴中孵育2分钟。然后加入样品或蛋白激酶C在30°C再孵育30分钟。

8.把管子放进开水浴或95°C加热块10分钟以终止反应。在凝胶电泳前把样品-直避光存放在4°C或-20°C。

9.把样品上样到胶上之前，往每个样品中加进1ul的80%甘油，以确保样品保留在上样孔中(说明书第II.F部分)。

10.每孔点样10ul,在0. 8%琼脂糖凝胶上以100V电泳15分钟分开样品，拍照。

检测结果:

说明:后面2组泳道“阳性(PC)"和“阴性(NC)"为试剂盒自带系统对照。

注:阳性条带以Gel pro4版凝胶光密度分析软件进行分析,测其IOD (integrated optical density)累积光密度参考值。按照百分比例计算PKC活性百分比

(以阳性对照I0D值为100，其余各组的PKC+ p-PKC总和为100分配IOD数值)

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