一、细胞基本属性：

原代细胞实验步骤：

一、取7-10d雄性SD大鼠，颈椎脱臼处死,浸泡于75％乙醇消毒3-5min。

二、在超净工作台中，将大鼠断头置于玻璃培养皿中，打开颅腔后取出全脑,放在盛有预冷的PBS玻璃培养皿中，去除小脑和间脑。

三、将大脑半球在干滤纸上缓慢滚动以去除软脑膜和脑膜大血管，再放在新的盛有预冷的PBS玻璃培养皿中。

四、用细解剖镊去除大脑白质、残余大血管和软脑膜，保留大脑皮质。

五、大脑皮质放于DMEM中，剪碎成约1mm3大小，放入50ml的离心管中，加入混合酶液I(0.05-0 .1％II型胶原酶，0 .025-0 .05％IV型胶原酶，200-400U DNaseI)，混匀后37℃水浴消化1-1.5h。

六、室温1 000×g离心8min，去上清液。

七、沉淀中加入20％BSA重悬浮，充分混匀，1 000×g，20min，4℃离心，去上清。

八、沉淀加入4ml混合酶液II( 0.05-0.1％的胶原酶/分散酶，0.05-0.1％I型胶原酶，100-300U DNaseI )重悬浮，混匀，37℃水浴消化0.5-1h，700×g室温离心6min，去上清液。

九、沉淀加入2ml DMEM培养液悬浮混匀，铺于经离心形成连续梯度的12ml 50％Percoll(25 000×g，60min，4℃)，1000×g，4℃离心10min。

十、靠近底部的红细胞层之上的白黄色的层面即为纯化的微血管段，吸出后DMEM

漂洗两次(离心1000×rpm，6min，室温)，去上清液。

加入DMEM培养液(20％FBS，4ug/ml嘌呤霉素 )重悬浮，接种于含5％的大鼠 血清37℃孵育过夜所制备的细胞培养皿中，置于37℃、5％CO2培养箱内静置培养24h后更换不含嘌呤霉素的混合培养基，随后隔天换液。

原代细胞使用方法：

是一种贴壁细胞，细胞形态呈内皮细胞样，在技术部标准操作流程下，细胞可传2-3代；建议您收到细胞后尽快进行相关实验。

客户收到细胞后，请按照以下方法进行操作。

1. 取出T25细胞培养瓶，用75%酒精消毒瓶身，拆下封口膜，放入37℃、5%CO2、饱和湿度的细胞培养箱中静置3-4h，以稳定细胞状态。

2. 贴壁细胞消化

1)吸出T25细胞培养瓶中的培养基，用PBS清洗细胞一次；

2)添加0.25%消化液1mL至T25培养瓶中，轻微转动培养瓶至消化液覆盖整个培养瓶底后，吸出多余消化液，37℃温浴1-3min；倒置显微镜下观察，待细胞回缩变圆后，再加入5ml培养基终止消化；

3)用吸管轻轻吹打混匀，按传代比例接种T25培养瓶传代，然后补充新鲜的培养基至5mL，置于37℃、5%CO2、饱和湿度的细胞培养箱中静置培养；

4)待细胞贴壁后，培养观察；之后按照换液频率更换新鲜的培养基。

3. 细胞收货脱落

1)收集所有细胞悬液，1000rpm，离心5min，保留沉淀；

2)添加0.25%消化液0.5mL至离心管中，重悬沉淀，放置于37℃消化3min(或4℃冰箱静置5-7min)；消化完向离心管内加入5ml培养基终止消化；

3)经1000rpm，离心5min，丢弃上清，用5ml培养基重悬沉淀，接种于新的培养瓶内；

4)待细胞贴壁后，培养观察；之后按照换液频率更换新鲜的培养基(37℃预热)。

5)原瓶内贴壁细胞按正常消化处理。

4. 细胞实验

因原代细胞贴壁特殊性，贴壁的原代细胞在消化后转移至其他实验器皿（如玻璃爬片、培养板、共聚焦培养皿等）时，需要对实验器皿进行包被，以增强细胞贴壁性，避免细胞因没贴好影响实验；包被条件常选用鼠尾胶原Ⅰ（2-5μg/cm2） ，多聚赖氨酸PLL（0.1mg/ml），明胶（0.1%），依据细胞种类而定。悬浮/半悬浮细胞无需包被。
公司正在出售的产品：
兔子宫平滑肌细胞

小鼠多巴胺神经元细胞
小鼠肌源性干细胞
小鼠卵巢成纤维细胞
小鼠肝外胆管上皮细胞
人胆囊上皮细胞
大鼠原代颈动脉平滑肌细胞
小鼠食管平滑肌细胞
小鼠食管上皮细胞
小鼠视乳头星形胶质细胞
小鼠视网膜Muller细胞
小鼠视网膜色上皮细胞
小鼠视网膜神经节细胞
小鼠视网膜微血管内皮细胞
小鼠输卵管上皮细胞
多型孢毛霉MucorpolymorphosporusPispek
洛巴伊口蘑(金福菇)Tricholoma lobayense
厚白盘革菌Aleurodiscus disciformis
桦剥管菌(桦滴孔菌)Piptoporus betulinus
稀硬木层孔菌Phellinus robustus
长根奥德蘑Oudemansiella radicata
桦癌褐孔菌Fuscoporia obliqua
簇生沿丝伞Naematoloma fasciculare
亚黑管孔菌Bjerkandera fumosa
亚大韧革菌Stereum insigne
猪II型肺泡上皮细胞肝色牛排菌（牛舌菌）Fistulina hepatica
热带小奥德蘑Oudemansiella canarii
紫萁小菇(天麻萌发菌)Mycena osmundicola
美丽链霉菌Streptomyces bellus
石斛小菇(天麻萌发菌)Mycena dendrobii