脂质体2000操作步骤/说明书

Invitrogen脂质体2000是zui为人熟知的转染产品之一。已知可为517种细胞提供高转染效率(表达转基因细胞的百分数)和活性(细胞抽提物中转入基因的酶产物活性)。

特点 两个关键性特点使得Lipofectamine 2000试剂的转染步骤快速简便：

(1)DNA-阳离子脂质体试剂的复合体可以直接加入到细胞培养基中，有血清也不怕脂质体2000

(2)转染后不需要除去Lipofectamine 2000试剂，无需换培养基

操作流程 事实上Lipofectamine系列产品操作流程都是又快又简单：稀释DNA以及Lipofectamine 2000，混合2种稀释液保温20分钟，加入培养细胞中孵育24-96小时检测结果。下面是Invitrogen提供的详细流程和注意事项。

转染前一天，胰酶消化细胞并计数，细胞铺板，使其在转染日密度为90%。细胞铺板在0.5ml含血清，不含抗生素的正常生长的培养基中。

对于每孔细胞，使用50μl无血清培养基(如OPTI-MEMⅠ培养基)稀释0.8μg-1.0μg DNA。脂质体2000

对于每孔细胞，使用50μl OPTI-MEMⅠ培养基稀释1μl-3μl LIPOFECTAMINE 2000试剂。Lipofectamine 2000稀释后保温5分钟(在30分钟内同稀释的DNA混合。保温时间过长会降低活性。) 注意：即使Lipofectamine 2000使用OPTI-MEMⅠ稀释，细胞也可以使用D-MEM培养。如果D-MEM做为Lipofectamine 2000的稀释液，必须在5分钟内同稀释的DNA混合。

混合稀释的DNA(第2步)和稀释的Lipofectamine 2000(第3步)。在室温保温20分钟。

注意：溶液可能会混浊，但不会影响转染。复合物可以在室温保持6小时稳定。

直接将复合物加入到每孔中，摇动培养板，轻轻混匀。

注意：如果在无血清条件下转染，使用含血清的正常生长培养基进行细胞铺板。在加入复合物前移去生长培养基，替换为0.5ml无血清培养基。脂质体2000

在37℃，5%的CO2中保温24-48小时，无须去掉复合物或更换培养基或者在4-5小时后更换生长培养基也不会降低转染活性。

在细胞中加入复合物24-72小时后，分析细胞抽提物或进行原位细胞染色，检测报告基因活性。这依赖于细胞类型和启动子活性。对稳定表达，在开始转染一天后将细胞传代至新鲜培养基中，两天后加入筛选抗生素。脂质体2000进行稳定表达需要数天或数周。

对于96孔板培养，不再需要提前一天进行细胞铺板，而可以直接在平板中制备复合物，然后将细胞悬浮液加入到复合物就可以了，这样进一步减少了转染时间。这种改进步骤已经过293-H，293-F，COS-7L和CHO细胞的试验，同传统方法相比活性稍低。快捷的步骤和蛋白表达细胞系的高效转染使得Lipofectamine 2000非常适用于96孔板的高通量转染，比如cDNA文库的筛选和蛋白瞬时表达。

适用细胞株范围 不同的转染试剂所适用的细胞株范围各不相同。一个实验室常常会用到不止一种细胞株，甚至是比较特殊的细胞株。一个转染试剂所适用的细胞株越多，当然越受用户的欢迎。根据Invotrogen的资料，Lipofectamine 2000已经证实可用于高达517种细胞株，覆盖了相当广的范围。要看看Lipofectamine 2000是否适用于你现有的细胞株，可以访问以下Invitrogen(http://www.invitrogen.com/content.cfm?pageID=9559&fuseaction=CellLines.dsp_searchRange)

适用的核酸类型和DNA大小有的转染试剂是为siRNA转染而设计的，有的则是为DNA转染设计。Lipofectamine 2000可以适用于包括DNA，siRNA, dsRNA, 荧光标记的Oligo, RNA等在内的核酸转染，这使得Lipofectamine 2000适用范围非常广泛，无论是基因表达分析的DNA转染，或者是RNAi，Lipofectamine 2000都能胜任，这样你就不需要为不同目的购买不同试剂了。值得注意的是，zui常用的DNA转染中有一个DNA大小的问题，太大的质粒不那么好转。我们暂时还没有找到Lipofectamine 2000相应的资料。

用量和价格 好东西往往不便宜。可是在实验室中，价格往往是有杀伤力的。Lipofectamine 2000用的剂量大吗?价格如何?根据说明书，24孔板转染每次用2ul左右，1.5ml Lipofectamine 2000大约可做750次24孔板转染，或者大约150次6孔板转染，而1.5ml Lipofectamine 2000当前市场价格4667元，0.75ml价格是2798元(可以磨到多少折扣就要看你的侃价功力了)。平均下来，再算上折扣，Lipofectamine 2000性价比还是挺高的。

注意事项 Lipofectamine 2000要求细胞铺板密度较高，以90%-95%为佳，这有助于减少阳离子脂质体细胞毒性造成的影响。Lipofectamine 2000可用于有血清培养基的转染，并且转染前后不需要换培养基，使得操作方便了许多，但是要注意制备转染复合物时要求用无血清培养基稀释DNA和转染试剂，因为血清会影响复合物的形成。复合物形成后是可以加入血清。这里要特别注意检测所用的无血清培养基是否能和Lipofectamine 2000匹配，比如已知CD293, SFM II, VP-SFM就不行。此外还应该留意，如果你研究的基因要求比较长的表达时间，比如细胞周期相关基因，或者时细胞表面蛋白，选择细胞铺板密较低的转染试剂，不适合用 Lipofectamine 2000。

对于大多数阳离子脂质体试剂，应优化DNA浓度和阳离子脂质体试剂量以得到zui大的转染效率。DNA和转染试剂的比例，通常推荐是1:2或者1:3，优化可以从0.5-5之间慢慢试。使用小剂量确定的优化条件可以用于进行大剂量的转染，只要根据培养板表面比例线性增加铺板细胞的数目、阳离子脂质体试剂和DNA量就可以了。

还有转染的时候培养基中不能添加抗生素。抗生素，比如青霉素和链霉素，一般对于真核细胞无毒，但阳离子脂质体试剂增加了细胞的通透性，使抗生素可以进入细胞。这降低了细胞的活性，导致转染效率低。所以，在转染培养基中不能使用抗生素，甚至在准备转染前进行细胞铺板时也要避免使用抗生素。这样，在转染前就不必润洗细胞。对于稳定转染，脂质体2000不要在选择性培养基中使用青霉素和链霉素，因为这些抗生素是GENETICIN选择性抗生素的竞争性抑制剂。另外，为了保证无血清培养基中细胞的健康生长，使用比含血清培养基更少的抗生素量。

阳离子脂质体应该在4度保存，要注意避免多次反复长时间开盖，因为可能会导致脂质体氧化而影响转染效率。当然还有要注意质粒的质量，质粒的内毒素是转染的大敌，Invitrogen自然是大力推荐自家的质粒纯化产品啦，这个嘛，看看生物通前面的质粒纯化专题有特别介绍就好啦

以上脂质体2000操作步骤/说明书来源：慧颖生物实验室摘录

王颖：    mail：wy_shijibu

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