Yeasen/翌圣生物 品牌
生产厂家厂商性质
上海市所在地
线粒体红色荧光探针
¥425D-盐(D-Luciferin Potassium Salt)
面议MycAway支原体去除试剂(1000×)
面议Human Fibronectin 人纤维连接蛋白
面议Collagenase IV胶原酶IV型
面议D- 盐(D-Luciferin, Sodium Salt)
¥748FITC标记鬼笔环肽(FITC Phalloidin)
¥785TRITC Phalloidin 罗丹明标记鬼笔环肽
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面议Annexin V-PE/7-AAD Apoptosis Detection Kit
Annexin V-PE/7-AAD细胞凋亡检测试剂盒
产品信息
产品名称 | 产品编号 | 规格 | 价格(元) |
Annexin V-PE/7-AAD Apoptosis Detection Kit Annexin V-PE/7-AAD细胞凋亡检测试剂盒 | 40310ES20 | 20 T | 480.00 |
40310ES50 | 50 T | 960.00 | |
40310ES60 | 100 T | 1680.00 |
产品描述
Annexin V-PE/7-AAD细胞凋亡检测试剂盒是用红色荧光染料PE(Phycoerythrin)标记的Annexin V作为探针,来检测细胞早期凋亡的发生,可用荧光显微镜、流式细胞仪或其他荧光检测设备进行检测。
其检测原理为:在正常的活细胞中,磷脂酰丝\氨酸(phosphotidylserine,PS)位于细胞膜的内侧,但在早期凋亡的细胞中,PS从细胞膜的内侧翻转到细胞膜的表面,暴露在细胞外环境中。Annexin-Ⅴ(膜联蛋白-V)是一种分子量为35-36KD的Ca2+ 依赖性磷脂结合蛋白,能与PS高亲和力结合。可通过细胞外侧暴露的磷脂酰丝\氨酸与凋亡早期细胞的胞膜结合。
另外,本试剂盒中提供的7-AAD可用来区分存活的早期细胞和坏死或晚期凋亡细胞。7-AAD是一种核酸染料,同PI有着相似的荧光特性,但其发射光谱较PI窄,对其他检测通道的干扰更小,在多色荧光分析中是PI的///佳替代品,可与Annexin V联合使用。该染料不能透过正常细胞或早期凋亡细胞的完整的细胞膜,但可穿透晚期凋亡细胞或者坏死细胞并与其内的DNA结合。因此将Annexin V-PE与7-AAD联合使用时,7-AAD则被排除在活细胞(Annexin V-/7-AAD-)和早期凋亡细胞(Annexin V+/7-AAD-)之外,而晚期凋亡细胞和坏死细胞同时被Annexin V-PE和7-AAD结合染色呈现双阳性(Annexin V+/7-AAD+)。
产品组分
编号 | 组分名称 | 产品编号/规格 | ||
40310ES20(20T) | 40310ES50(50T) | 40310ES60(100T) | ||
40310-A | 重组人Annexin V/PE*(rh Annexin V/PE) | 100 µL | 250 µL | 500 µL |
40310-B | 7-AAD Viability Staining Solution(20µg/mL) | 200 µL | 500 µL | 1.0 mL |
40310-C | 1×Binding Buffer | 10 mL | 25 mL | 50 mL |
*来源于大肠杆菌(E.coli),分子量为35.8 KDa,纯度>98%(SDS-PAGE&HPLC)
运输与保存方法
冰袋(wet ice)运输。-20 ℃避光长期保存,避免反复冻融,一年有效。
【注】:如果需要在短时间内多次重复使用,可以在4 ℃避光保存,半年有效。
注意事项
1)试剂在开盖前请短暂离心,将盖内壁上的液体甩至管底,避免开盖时液体洒落。
2)由于细胞凋亡是一个快速的过程,建议样品在染色后1小时之内进行分析。
3)对于贴壁细胞,消化是一个关键步骤。贴壁细胞诱导细胞凋亡时如有漂浮细胞,需收集漂浮细胞和贴壁细胞后合并染色。处理贴壁细胞时要小心操作,尽量避免人为的损伤细胞。胰\酶消化时间过短,细胞需要用力吹打才能脱落,容易造成细胞膜的损伤,7-AAD摄入过多;消化时间过长,细胞膜同样易造成损伤,甚至会影响细胞膜上磷脂酰丝\氨酸与Annexin V-PE的结合。消化时将胰\酶铺满孔板底后,轻摇时胰\酶与细胞充分接触,然后倒掉大部分胰\酶,利用剩余的少量胰\酶再消化一段时间,待细胞间空隙增大,瓶底呈花斑状即可终止。在消化液中尽量不用EDTA,EDTA会影响Annexin V与PS的结合。
4)如果样品来源于血液,请务必除去血液中的血小板。因为血小板含有PS,能与Annexin V结合,从而干扰实验结果。可以使用含有EDTA的缓冲剂并低速离心(200×g)洗去血小板,然后用Annexin V结合缓冲液清洗细胞,以避免残留的EDTA会螯合Ca2+。
5)7-AAD为潜在致癌物,操作时请采取防护措施,穿防///护///服、戴手套等。
6)Annexin V-PE和7-AAD是光敏物质,在操作时请注意避光。
使用说明
1 样品染色
1) 悬浮细胞:300 g,4 ℃离心5 min收集细胞。
贴壁细胞:用不含EDTA的胰\酶消化后,300 g,4 ℃离心5 min收集细胞。胰\酶消化时间不宜过长,以防引起假阳性。
2)用4 ℃预冷的PBS洗涤细胞2次,每次均需300 g,4 ℃离心5 min。
3)吸弃PBS,加入100 μL 1×Binding Buffer重悬细胞,调节其浓度为1×106细胞/mL。
4)加入5 μL Annexin V/PE和10 μL 7-AAD,轻轻混匀。
5)避光、室温反应10-15 min。
6)加入400 μL 1×Binding Buffer,混匀,样品在1 h内检测。
注:为了避免洗涤细胞时损失细胞,在吸液时可以用大的Tip头套上小的Tip头吸液。
2 观察检测
A、流式细胞仪分析
1)用流式细胞仪检测,激发波长Ex=488nm;发射波长Em=578 nm,Annexin V-PE的橙红色荧光建议使用FL2通道检测;激发波长Ex=546 nm;发射波长Em=647 nm,7-AAD红色荧光建议使用FL3通道检测。用CellQuest等软件进行分析,绘制双色散点图(two-color dot plot),PE为横坐标,7-AAD为纵坐标。每个样采集10,000 events。典型的实验中,细胞可以分成三个亚群,活细胞仅呈很低强度的背景荧光,早期凋亡细胞仅呈较强的橙红色荧光,晚期凋亡细胞呈橙红和红色荧光双重染色。
2)荧光补偿调节:使用未经凋亡诱导处理的正常细胞,作为对照进行荧光补偿调节去除光谱重叠和设定十字门的位置。
B、荧光显微镜观察
1)滴一滴上述染色后的细胞悬液于载玻片上,并用盖玻片盖上细胞;
2)对于贴壁细胞来说,也可直接用盖玻片来培养细胞并诱导细胞凋亡;
a 将细胞于盖玻片上生长,用适当的凋亡诱导剂诱导细胞凋亡,并设立阴性对照组;
b 用PBS洗涤细胞两次;
c 在500 μL的Binding Buffer中加入5 μL Annexin V-PE,10 μL 7-AAD染液混匀;
d 将上述溶液滴加于盖玻片表面,使长有细胞的盖玻片表面均匀覆盖;
e 室温避光孵育5 min。
3)将盖玻片倒置于载玻片上,在荧光显微镜下用双色滤光片观察。滤光片(罗丹明)观察Annexin V-PE 荧光信号呈橙红色;用激发波长546 nm,发射波长647 nm,观察7-AAD荧光信号呈红色。
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HB200911