产品信息

产品描述

金担子素A，又名Aureobasidin A、AbA、Basifungin、短梗霉素A，是从丝状真菌Aureobasidium pullulans No. R106中分离出来的环酯肽类抗生素，是一种是一种环状肽、抗真菌的抗生素，具有很强的抗真菌能力，是肌醇磷酸化神经酰胺合成酶AUR1的抑制剂。在较低的浓度下(0.1-0.5 μg/mL)即可对酵母产生毒性。对其敏感的真菌种类包括：出牙酵母(Saccharomyces cerevisiae)、粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)、光滑念珠菌(Candida glabrata)、构巢曲霉(Aspergillus nidulans)和黑曲霉(A. niger.)。作用机制是Aureobasidin A抑制了真菌生长所依赖的肌醇磷酰胺(inositol phosphorylceramide, IPC)合成酶的活性，干扰鞘脂合成，从而进一步杀死菌株。编码IPC合成酶的基因研究较多的有来自酿酒酵母菌的AUR1基因，以及构巢曲霉的AURA基因，两者具有同源性。通过对这些编码基因进行突变即可使得菌株对Aureobasidin A产生抗性，如AUR1-C基因。

Aureobasidin A非常适合用作阳性克隆子筛选用的药物选择性标记。Aureobasidin A抗性也是酵母单/双杂交研究中理想的报告子。本品为溶于甲醇的Aureobasidin A溶液，浓度为1 mg/mL。具体的工作浓度取决于宿主细胞的敏感度（见表1. AbA对各种酵母菌的低抑菌浓度(MIC)）。

表1 Aureobasidin A对各种酵母菌的低抑菌浓度

产品性质

运输与保存方法

冰袋运输。-20℃保存，有效期2年。建议分装后-20℃干燥保存，避免反复冻融。不建议4℃和常温下长期存放。

产品应用

1. 酵母双杂交研究

2. 酵母单杂交研究

3. 严格的酵母药物选择标记

4. Aureobasidin A抗性是酵母杂交研究的理想报告因子  

操作步骤（抗AbA的酵母转化系统）

1. 加入0.5 mL过夜培养的酵母到50 mL YPD培养基中（配方：1 L液体培养基含有10 g yeast extract，20 g polypeptone，20 g D-glucose；固体培养基另外加入2%琼脂）。

2. 30℃培养约6小时，测定OD₆₆₀为1-2。使用二倍体时，测定OD₆₆₀为2-4。

3. 1,000×g离心5分钟。

4. 用10 mL Solution A（配方：100 mM Lithium acetate，10 mM Tris-HCl pH 7.5，1 mM EDTA）悬浮沉淀，1,000×g离心5分钟。

5. 用Solution A重悬沉淀，直到OD₆₆₀为150。

6. 在管内分取100 µL细胞悬浮液，30℃培养1小时。

7. 加入5 µg载体（环状或线性DNA）和150 µg Carrier DNA（已经过100℃加热10分钟，并迅速冷却）。

注：pAUR101需使用线性DNA进行转化。使用环状DNA会降低转化效率甚至转化不成功。pAUR112和pAUR123需使用完整的质粒DNA进行转化。

8. 加入850 µL Solution B（配方：取40 g Polyethylene Glycol 4000溶于100 mL Solution A充分溶解，需要现用现配），轻轻混匀。

9. 30℃培养30分钟后，42℃培养15分钟。

10. 室温放置10分钟。

11. 5,000 rpm离心1分钟，用5 mL YPD培养基悬浮沉淀。

12. 30℃培养6小时~过夜。

13. 5,000~10,000 rpm离心，用1-10 mL 0.9% NaCl悬浮沉淀。

14. 在YPD选择培养基平板（含一定浓度的AbA，依菌株类型而定）上接种100 µL细胞悬液。30℃培养3-4天后转化完成。

15. 挑取阳性转化子，和/或测定转化效率（以每微克质粒DNA转化的菌落数来表示）。

注意事项

1. 为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。

2. 本产品仅用于科研用途，禁止用于人身上。

3. AbA的最佳工作浓度因宿主细胞不同而有差异，可根据低抑菌浓度(MIC)来确定。

使用浓度

【具体使用浓度请参考相关文献，并根据自身实验条件（如实验目的，细胞种类，培养特性等）进行摸索和优化。】

使用方法（数据来自于公开发表的文献，仅供参考）

细胞实验（体外实验）

Aureobasidin A通过神经酰胺毒性和必需肌醇磷酸化神经酰胺的抑制而抑制酵母细胞的生长。^[1]

利用合适的酶切位点将所有DNA片段克隆到Y1H载体pAbAi中，根据酵母转化系统2手册(Clontech, Mountain View, USA)，将构建好的pAbAi用BstbI线性化，转化到酿酒酵母Y1HGold菌株。携带目的DNA片段的克隆在添加了Aureobasidin A (浓度为100-900 ng/mL)的合成脱落培养基上成功进行筛选。^[2]

将SlBES1基因的开放阅读框(ORFs)扩增并连接到pGBKT7-GAL4BD质粒中， 将融合蛋白GAL4BD-SlBES1转化至Y2H金酵母细胞中，SD/−Trp培养基用于培养酵母转化，用X-α-gal鉴定转化子α-半乳糖苷酶活性，用Aureobasidin A筛选AUR1-C的基因表达。^[3]

客户使用本产品发表的文献

研究中使用的载体pAbAi含有报告基因Ura3和对Aureobasidin A (AbA)耐药的选择性基因AUR1-C，将目标序列F16、F20或F73分别插入到AUR1-C基因上游的多个克隆位点。为了避免酵母内源转录因子与目标顺式元件相互作用的干扰，事先确定用于单个酵母菌落择的低AbA浓度。将3种酵母和含p53-AbAi阳性对照分别悬浮在0.9% NaCl中，OD₆₀₀调整为0.005。随后，将100μL样品涂于含0、100、200、500和1000 ng/mL AbA的SD/-Ura固体介质(Yeasen Co., China)表面。将平板倒置，在30℃下培养3-5天，AbA的适宜浓度为500 ng/mL。^[4]

图1 GmWRKY31蛋白与含有F16、F20、F73、delF16、delF20或delF73片段的酵母菌互作

参考文献

[1] Vanessa Cerantola, et al. Aureobasidin A arrests growth of yeast cells through both ceramide intoxication and deprivation of essential inositolphosphorylceramides. Mol Microbiol. 2009 Mar;71(6):1523-37.

[2] Gong P, Song C, et al. Physalis floridana CRABS CLAW mediates neofunctionalization of GLOBOSA genes in carpel development. J Exp Bot. 2021 Oct 26;72(20):6882-6903.

[3] Su D, Xiang W, Wen L, et al. Genome-wide identification, characterization and expression analysis of BES1 gene family in tomato. BMC Plant Biol. 2021;21(1):161.

[4] Dong H, Tan J, Li M, Yu Y, Jia S, Zhang C, Wu Y, Liu Y. Transcriptome analysis of soybean WRKY TFs in response to Peronospora manshurica infection. Genomics. 2019 Dec;111(6):1412-1422. doi: 10.1016/j.ygeno.2018.09.014. Epub 2018 Sep 27. PMID: 30267765.

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