产品简介

潮霉素B（Hygromycin B）是由吸水链霉菌（Streptomyces hygroscopicus）代谢产生的一种氨基糖苷类抗生素，通过干扰70S核糖体易位和诱导对mRNA模板的错读而抑制蛋白合成，从而杀死原核（如细菌）、真核（如酵母菌，真菌）和高等哺乳动物真核细胞。

大肠杆菌（ Escherichia coli.）来源的潮霉素抗性基因（hyg或hph），编码潮霉素B磷酸转移酶，将潮霉素B转化成不具有生物活性的磷酸化产物，从而起到解毒作用。针对这一原理，潮霉素B是一种非常有用的选择性标记，用来筛选和维持培养成功转染潮霉素抗性基因的原核或者真核细胞。另外，由于作用模式的差异，常与G418 (GeneticinTM)，Zeocin™ 和Blasticidin S联合使用进行双抗性阳性细胞株的选择。潮霉素B还能用作抗病毒剂，因其选择性渗透进入因病毒感染增强通透性的细胞，且具有抑制翻译的功效。还可混合入动物饲料中起到驱虫功能。

本品是无菌的潮霉素B溶液（50 mg/mL in PBS buffer），可直接用培养液稀释使用。

产品信息

组分信息

储存条件

2~8℃保存，避免反复冻融。有效期2年。

使用说明

1. 常用筛选浓度

潮霉素B用来筛选稳转株的工作浓度需要根据细胞类型、培养基、生长条件和细胞代谢率而变化，推荐使用浓度为50-1000 μg/mL。对于第一次使用的实验体系建议建立杀灭曲线（kill curve），即剂量反应性曲线，来确定最佳筛选浓度。

一般而言，哺乳动物细胞50-500 μg/mL；细菌/植物细胞20-200 μg/mL；真菌300-1000 μg/mL。

2. 杀灭曲线的建立

为了筛选得到稳定表达目的蛋白的细胞株，需要确定能够杀死未转染宿主细胞的抗生素浓度，可通过建立杀灭曲线（剂量反应曲线）来实现，至少选择5个浓度。

1）第一天：未转化的细胞按照20-25%的细胞密度铺在合适的培养板上，37℃，CO2培养过夜。【注】：对于需要更高密度来检测活力的细胞，可增加接种量。

2）根据细胞类型，设定合适范围内的浓度梯度。以哺乳动物细胞为例，可设定50，100，250，500，750，1000 μg/mL。先用去离子水或者PBS buffer按照1:10的比例将母液稀释到5 mg/mL，然后按照下表稀释到相应浓度的工作液。

3）第二天：替换旧的培养基，换用新鲜配制的含有相应浓度药物的培养基。每个浓度做三个平行孔。

4）接下来每3-4天更换新的含药物培养基。

5）按照固定的周期（如每2天）进行活细胞计数来确定阻止未转染细胞生长的恰当浓度。选择在理想的天数（通常是7-10天）内能够杀死绝大多数细胞的浓度为稳定转染细胞筛选用的工作浓度。

3. 稳定转染细胞的筛选

1）转染48 h后，用含有适当浓度的潮霉素B筛选培养基来传代细胞（直接传代或者稀释后传代）。【注】：细胞处于活跃分裂状态时抗生素的杀伤。则当细胞过于稠密，其效率会降低。为了得到较好的筛选效果，将细胞稀释至丰度不超过25%。

2）每隔3-4天更换含有药物的筛选培养液。

3）筛选7天后观察并评估细胞克隆（集落）的形成情况。集落的形成可能还需要一周或者更多的时间，这取决于宿主细胞类型，转染，以及筛选效果。

4）挑取并转移5-10个抗性克隆于35 mm细胞培养板，继续用含药物的筛选培养液维持培养7天。

5）之后更换正常培养基培养即可。

注意事项

1. 潮霉素B的抗性基因（hyg或hph）除了来自E. Coli.外，还发现于其他的菌株，包括Streptomyces hygroscopicus和Klebsiella pneumoniae。

2. 本品为有毒化合物，避免与皮肤和眼睛接触，请小心操作。

3. 为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。

4. 本产品仅用于科研用途，禁止用于人身上。